测序技术简史（三）| 当今的主流：大规模并行高通量测序技术

回顾了测序技术发展的四个阶段，我们看出，经过多轮技术路线的淘汰，有两种大规模并行高通量测序技术脱颖而出，因其在成本、速度和准确度方面达成了很好的平衡，因此逐渐成为了当今世界的主流。

一、桥式PCR测序

桥式扩增测序技术在之前的技术基础上做了革命性改进，这项技术的核心是DNA合成的可逆性末端循环，其创新点在于两方面：

桥式扩增技术示意图

1、在化学上实现了末端循环（合成）测序和“循环可逆“的信号读取；

2、在物理上，用DNA模板分子簇的”裸露“DNA合成来实现大规模高通量并行测序，一个面积为20平方厘米的测序载片可以形成约40亿个DNA分子簇，极大拓展了通量，使CCD光学检测系统可以一次性读取视野内所有模板的测序信号，并继续下一轮合成反应，形成高效循环。当这些测序载片上几十亿个DNA分子簇显示在CCD成像图上时，就像是哈勃望远镜超深空照片上密集而璀璨的星系，美妙非凡。

测序载片成像图 与 哈勃超深空照片

这种测序方法的另一大优势在于实现了“双向”测序，充分发挥了“中间”片段（即没有序列但方向明确的 “空洞”片段）的作用，方便序列的组装。

在DNA模板复制扩增方面，桥式PCR技术中DNA模板复制原理类似核裂变中的链式反应，1个DNA片段复制为2份，以2份为模板复制得到4份，如此循环……，这种指数型复制方式的优点是复制速度很快，但以复制品为模板进行下一轮复制，过程中会产生复制错误并积累下来，导致少量DNA信息出现失真。

二、DNB测序

当今另一种主流的大规模并行高通量测序方法，是环化单链DNA（cssDNA : circle single-strand DNA）+DNB纳米球(DNA Nano-Ball)测序技术，其具体实现方法可谓独辟蹊径。

DNB纳米球技术示意图

在这项组合技术中，DNA长链在超声波或酶的作用下随机打断后形成模板DNA片段，在接头作用下连接成一个圆环，这就是环化单链DNA（cssDNA），通过滚动复制，形成一个含有300—500份拷贝的DNA纳米球（DNB），随后这些制备成功的DNB会被加载到测序载片（Flow cell）上并附着、固定在预制的纳米孔位，为下一步测序做好准备。

测序载片经过精密的半导体加工工艺在表面形成结合位点阵列，实现DNA纳米球的规则排列吸附，这一技术被称为DNB规则阵列技术（Patterned Array），这项技术使得测序载片上的活性位点呈矩阵网格排列，所有活性位点间距保持整齐一致，每个位点只结合固定一个DNA纳米球（DNB），可保证不同纳米球的光信号不会相互干扰，保证了测序的准确度，同时提高了芯片利用效率，实现了极好的成像效率和最优的试剂用量。这样的一张载片可以布置数十亿个活性位点，使得它的成像图就像是哈勃望远镜把镜头对准了星团的中央。

DNB纳米球规则阵列载片成像图与

大麦哲伦星系中的球状星团

在DNA模板复制扩增方面， 环化单链DNA很好地避免了复制错误积累的问题。环化单链DNA（cssDNA）的复制原理相当于始终以原文件为模板复制新的文件，复制产生的误差极小。

这种测序技术下一致性序列的准确率可达99.999%，准确率高居各类测序方法榜首，十分适合做人类全基因组测序。除此之外，这个方向上还有一个亮点技术是基于分子共标签技术和高通量短读长测序技术开发的stLFR单管长片段建库技术（stLFR-single-tube Long Fragment Read），该技术可间接得到长片段DNA数据（达到几十Kb），并且能区别父源或母源的单体型序列，且能在单管中完成所有实验流程。

综合来说，两种主流的高通量测序技术，都很好地兼顾了通量、准确度和成本等多个方面，因此才在技术演进的反复洗练中胜出，并成为了今天的主流。目前这两种高通量测序技术还有较大的改进潜力，尤其是与当前日益成熟的长片段技术相结合，大规模并行高通量测序（MPS）将发挥出其真正的威力。

未完待续，详见下期精彩

参考文献

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