上一节我们讲到了，肿瘤外显子数据处理系列教程（四）比对结果的质控，接下来我们将通过igv可视化的方式，对bam文件进行一个深入的了解，同样也是以这个样本case1_biorep_A_techrep为例。
bam（或者是sam，cram）文件，是比对后拿到的文件，sam文件是纯文本，非常占用存储空间，bam是sam的二进制格式，cram则是进一步压缩后的格式，这三者所记录的内容是一致的，但是bam文件是最常用的。记录了每一条reads比对到参考基因组的结果，主要有11列比较重要的信息（每一列以制表符分开）：
| 列 | 列名 | 简介 | 举例 |
|---|---|---|---|
| 1 | QNAME | reads的名称 | case1_biorep_A_techrep.89335031 |
| 2 | FLAG | 由二进制数表示，每一个数字代表一种比对情况，这里的值是符合情况的数字相加总和，如75=1+2^1^ +2^3^+2^6^ | 129 |
| 3 | RNAME | 参考序列，一般是染色体 | chr17 |
| 4 | POS | 比对到染色体位置 | 42852401 |
| 5 | MAPQ | mapping质量 | 60 |
| 6 | CIGAR | MIDNSHP=XB这10个字符代表不同的含义，M比对成功，I插入，D删除 | 76M3D |
| 7 | RNEXT | 配对reads比对到的参考序列（染色体） | chr11 |
| 8 | PNEXT | 配对reads比对到染色体的位置 | 96427099 |
| 9 | TLEN | 可以理解为测序是文库插入片段长度 | 0 |
| 10 | SEQ | 序列，fq文件的第二行 | GCTTC…CCAGC |
| 11 | QUAL | 质量值，fq文件第四行 | @@@?D…CA@DD |
更多的说明可以查看官方教程：
https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf
由于原bam文件特别大，下载到本地载入igv非常耗资源，所以我们就提取一个小的bam进行演示。首先，要构建索引，提取小bam，这里我们提取17号染色体的信息：chr17。再对小bam文件构建索引，因为igv要求bam文件需要带索引才能载入。
samtools index case1_biorep_A_techrep.bam
samtools view -h case1_biorep_A_techrep.bam chr17 | samtools view -Sb - > small.bam
samtools index small.bam
对比一下大小，如果还觉得太大，上面提取的参数chr17可以改为类似chr17:42850000-42950000。
12G 8月 29 05:46 case1_biorep_A_techrep.bam
694M 8月 29 12:15 small.bam
然后把小bam文件及其索引下载到本地，打开IGV，加载hg38参考基因组，然后把bam文件拖到IGV窗口中。
点击17和右上角的+
直到标尺显示的尺度小于30kb，igv默认小于30kb才会显示reads的信息。
也可以在搜索框中输入感兴趣的位置或者基因，比如chr17:42,850,644-42,853,784或者AOC3
这里我们可以看到有5条轨道：
第一条是Coverage即覆盖深度，可以直观的看出染色体的每一处reads的覆盖情况，因为我们是外显子捕获测序，所以极大部分的reads都覆盖到了参考基因组的外显子区域及其侧翼区域。值得注意的是在这一行开头有峰的高度范围，且默认是随覆盖深度动态变化的。
第二条是Junctions，一般用于转录组数据，可以看可变剪切，默认是不显示的，这里是我之前设置。
第三条是bam文件中reads详细信息，每一块代表一条reads，将鼠标放到某一条reads上，就会呈现该reads的详细比对信息，与bam文件的中信息相对应。而且可以通过鼠标右键，调出设置菜单，方便进一步探索。
第四条是sequence，参考基因组的序列碱基信息，当放大至一定程度时就会显示出来。
第五条是参考基因组注释信息，可以看到有基因、外显子、内含子、5'UTR、3'UTR等，还可以右键选择显示基因的各个转录本。
可以看到，这些reads大多数是灰色的，部分是透明，少部分是红色、蓝色、棕色等等，不同的颜色有不同的含义。
灰色：指的是比对成功，没有其他特别的含义
白色：指的是比对失败，对应的是bam文件中第5列，MAPQ比对质量值，我们把鼠标放到透明的reads上就可以看到
红色和蓝色：igv会根据配对的两条reads的距离，即bam的第9列TLEN，可以理解为测序时文库插入片段长度，来判断是否存在染色体的结构变异deletions,insertions,inter-chromosomal rearrangements。红色代表插入片段大于期望值，可能是deletions的证据，蓝色代表插入片段小于预期，可能是insertions的证据。我们可以通过右键选择view as pairs来进一步理解这个含义。蓝色的两条reads重叠，而红色的reads距离都比较大
其他颜色：指的是这条reads所配对的另一条reads没有比对到同一条染色体，不同颜色代表不同染色体，具体看下图：
比如下面棕色的reads，代表与之配对的reads比对到了11号染色体上了：
grep 89335031：$ samtools view -h case1_biorep_A_techrep.bam chr11 | grep 89335031
case1_biorep_A_techrep.89335031 65 chr11 96427099 60 76M chr17 42852401 0 AAATTGAATCTGCAATTTCTCAACCCATTAAATTGTTCATCAATGCTGAACTAATACAAGAGTTACATTAATAAGC @>>??G?@AEDEDCAAAADCECADBBCAAABA?@FAAECAEBA@EEDCAADDABAADCBEAF@A@EC@@=A@>@DD NM:i:0 MD:Z:76 MC:Z:76M AS:i:76 XS:i:19 RG:Z:case1_biorep_A_techrep
$ samtools view -h case1_biorep_A_techrep.bam chr17 | grep 89335031
case1_biorep_A_techrep.89335031 129 chr17 42852401 60 76M chr11 96427099 0 GCTTCCAAGGAGAAAGACTAGTTTATGAGATAAGCCTCCAAGAGGCCTTGGCCATCTATGGTGGAAATTCCCCAGC @@@?DDCAFCAEABAE@DC@E@@@@ADAFAAAAEEBCDCBAFAFDECDAFDEDBAEDBBFD@GD@AAA@E@CA@DD NM:i:0 MD:Z:76 MC:Z:76M AS:i:76 XS:i:0 RG:Z:case1_biorep_A_techrep
关于颜色更多的介绍，请参考igv官方文档：
http://software.broadinstitute.org/software/igv/interpreting_insert_size
不同组学的测序策略不同，这里展示的是外显子组的bam文件，还有其他组学的bam文件也可以在igv中可视化，对此推荐大家看一下不同组学测序数据拿到的bam文件在igv可视化结果的区别：各种NGS组学数据分析异同点视频讲解
介绍到这里只讲了一部分，还有bam文件载入igv也可以看变异位点，SNP和INDEL，这部分我们留到后面分析拿到vcf文件后再继续讨论。
下一期我们将走gatk最佳实践流程，并且会详细介绍每一步分析的原理以及需要注意的细节。
然后提一个小问题给读者：
如果你的测序数据qc结果如上所示，你会怎么处理？
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