褪下PD-L1的糖衣，增加anti-PD-1/PD-L1疗法的精准性

程序性死亡1（PD-1）和程序性死亡配体1（PD-L1）阻断免疫治疗的成功，在临床上给癌症治疗带来了革命性的变化，为癌症患者的生存带来了显著的改善。大量靶向PD-1（如纳武单抗，可瑞达等）或PD-L1（如阿特珠单抗等）的免疫检查点抑制剂已获得美国FDA批准作为多种肿瘤的二线甚至一线用药。然而，大量证据表明，对患者肿瘤组织中PD-L1水平的病理学检测并不能持久地作为anti-PD-1/PD-L1疗法的疗效预测指标，甚至其可信度都存疑。因为事实上不仅PD-L1阳性的患者，PD-L1阴性的患者有时也能对anti-PD-1/PD-L1疗法表现出良好的反馈。因此，确认PD-L1水平是否是临床预后的可靠标志物是anti-PD-1/PD-L1疗法成为精准医疗的重要标准。

作为一种转录后修饰，糖基化能够调控包括蛋白合成、蛋白定位、蛋白功能等多种细胞生物过程。在此基础上，研究者们指出细胞表面PD-L1的N连接糖基化占据了我们所观察到的PD-L1分子量的约52%，这极有可能会影响到PD-L1抗体对其的识别，他们猜测，是否将PD-L1表面的N连接糖基化移除能够增强PD-L1的可识别性呢？

图1

为判断PD-L1表面的N连接糖基化是否会影响到其抗体可识别性，研究者们首先用PNGase F（去糖基化试剂）处理肺癌以及乳腺癌细胞后再加入PD-L1抗体（FDA批准使用的PD-L1抗体包括阿特朱单抗）进行免疫荧光检测，发现PNGase F处理过的细胞比未处理的细胞表现出显著增强的PD-L1荧光，显示出PNGase F对PD-L1抗体识别PD-L1有明显的促进作用。同时，PNGase F处理能够显著降低细胞对刀豆蛋白A（Con A，能够识别糖蛋白中的甘露糖以及葡萄糖）的结合能力这一结果证实了PNGase F处理对细胞表面糖基化的去处作用。接下来研究者们使用饱和结合分析法发现在去除糖基化后肺癌细胞的PD-L1抗原抗体的结合能力比去除糖基化之前提升了超过20倍。除此之外，研究者们进一步发现去除糖基化后多种肺癌以及乳腺癌细胞（MCF-7除外）中PD-L1的免疫组化H-score得到了明显的提升。以上这些结果均说明PD-L1表面的糖基化阻碍了抗体对其的识别能力，而去除糖基化则能改变这一情况（图1）。

图2

在接下来使用包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌以及胰腺癌的肿瘤组织微阵列IHC染色实验中，研究者们同样发现在去除糖基化之后PD-L1的H-score显著提升，显示出抗体对其的识别能力增强。有趣的是，这项实验的结果表现出明显的两极分化。这些组织中约有一半在经去糖基化处理后H-score并无变化，而另一半则在经处理后H-score提升超过2倍，介于二者中间的组织少之又少。而在针对某一特定癌种（肺癌以及结直肠癌）的患者组织进行测试的时候所得到的结果也与之类似。更重要的是，当对肺癌患者的肿瘤组织进行去糖基化处理后，研究者发现使用同样的检测方法表现出PD-L1阳性从而可适用于纳武单抗或可瑞达疗法的患者比例明显增加。这些结果说明去糖基化能够将一些PD-L1假阴性的患者重新纳入到免疫检查点抑制疗法之中（图2）。

图3

为进一步建立PD-L1的IHC读数与免疫疗法临床疗效之间的关联，研究者们收集了95例经免疫疗法治疗后或正在治疗（大多为纳武单抗）的肿瘤组织样本，对其的检测发现使用PNGase F处理同样能够提升PD-L1的H-score。与前述结果类似，在这些样本中，同样是去糖基化前后H-score未表现出变化或变化超过2倍的样本居多。其后，他们还发现了更加引人注目的结果，即仅有在使用PNGase F处理组织后，PD-L1的H-score读数与无进展生存率（PFS）方可显示出相关性。也就是说，只有经去糖基化处理后的PD-L1 H-score读数才可作为纳武单抗治疗的预后预测指标。使用患者总生存率（OS）与PD-L1的H-score读数所进行的统计学分析也表现出了类似的规律（图3）。

图4

一般来说，肺癌患者如PD-L1表达低于1%则不会被推荐使用anti-PD-1/PD-L1疗法，表达为1-49%时推荐使用anti-PD-1/PD-L1疗法与化疗联用，而大于49%时则可使用单独anti-PD-1/PD-L1疗法进行治疗。研究者们接下来单就肺癌患者（44例）进行了一系列的研究，他们发现：首先，肿瘤组织的去糖基化同样能够提升肺癌患者PD-L1水平（H-score或TPS）与无进展生存期的相关性；其次，约16%（7例）原本PD-L1检测为0-49%的患者样本在经去糖基化处理后该数值升高到49%以上，他们在经anti-PD-1/PD-L1疗法治疗后的生存期完全能够与原本PD-L1检测值大于49%的患者媲美，这显示出他们的治疗方法选择在一定程度上受到了PD-L1检测失准的干扰，他们原本就应该选择使用单独anti-PD-1/PD-L1疗法而不是与化疗的联用。而那些在去糖基化后PD-L1为1-49%而原本被诊断为<1%无法使用免疫治疗的患者在经anti-PD-1/PD-L1疗法治疗后则表现出比即使去糖基化后仍为1%的患者明显更长的生存期（图4）。

图5

进一步的统计学分析表明，当使用统一的High/low分级标准时，只有去糖基化后的PD-L1读数能够与无进展生存期表现出统计学相关性。而对随机选出的去糖基化诱导PD-L1 H-score升高超过2倍的3位患者中的2位进行PD-1抑制剂治疗后其肿瘤明显缩小。这一结果也对文章的结果进行了证实。