肝癌早期诊断仍然是一项难题。在之前的介绍中,我们探讨了如何使用联合检测的方式进行肝癌诊断,并介绍了一项微流控肝癌诊断系统。除了开发新的标志物进行联合检测外,液体活检是肝癌早期诊断另一项重要的方向,特别是cfDNA的应用,大大提高了肝癌的早期诊断率。本期推送主要介绍目前主要的肝癌液体活检系统。
我国的肝癌新发和死亡病例占到全球的50%以上,肝癌极大地威胁着中国人的健康。由于肝癌起病相对隐匿,一旦出现临床症状往往已是中晚期,患者已失去了进行手术等根治性治疗的机会,而化疗、放疗等手段对肝癌也效果不佳,因此患者预后往往较差,5年生存率只在20-30%水平徘徊。
然而,目前尚无诊断标志物能实现较好的早期诊断效果,现有的肝癌常用标志物甲胎蛋白(AFP)敏感性较差,单独应用常常出现漏诊。为了改善肝癌的早期诊断效果,目前常用的手段是结合AFP、AFP-L3、DCP等蛋白标志物的联合检测(业内称为GALAD模型),并配合相应的影像学手段进行综合诊断。除此以外,新兴的液体活检被人们寄予了厚望。液体活检针对癌症患者血液中游离的细胞、外泌体、蛋白和DNA进行检测,其中后者携带着与原发瘤灶相同的癌症“身份信息”,因此对这些游离的肿瘤物质进行检测可实现癌症的筛查、诊断和疗效评估。相较传统的组织活检技术,取血进行的液体活检损伤小,因此成为了癌症研究领域最炙手可热的课题。
液体活检的特点
液体活检技术主要包括循环肿瘤细胞(CTCs)检测、循环肿瘤DNA(ctDNA)检测、循环microRNA和外泌体等。CTCs在血液中含量极少(血液中占约比为百万分之一),且不管是物理法还是免疫法都无法完全捕获所有CTCs(异质性)。ctDNA(约1-100ng/ml)混杂在大量游离DNA中,要想寻找其突变,缺失,插入,重排,拷贝数异常,甲基化信息也是非常困难的。常用的PCR和NGS的方法各有特点,但仍需要进一步研究开发。外泌体虽然量相对较多,携带信息多样化,目前研究较火,成熟的产品倒很少见。
目前针对液体活检应用技术最多的是PCR和NGS。PCR技术成熟,但只针对已知突变序列,在处理肿瘤异质性上具有很强的局限性。NGS可检测未知突变,且检测数量不受限制,但技术复杂,数据处理庞大。尽管有企业利用AI,大数据等技术进行NGS的信息处理,但仍难有比较成熟的产品。
肝癌的液体活检
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HCCBloodTest
HCCBloodTest由德国分子诊断公司EPIGENOMICS开发。该技术最早的记录源于2015年Hepatology报道的一篇文章。SEPT9作为细胞分裂和肿瘤抑制的关键调节因子,SEPT9的高甲基化与肝癌发生有关。SEPT9作为HCC相关诊断生物标志物,比AFP等蛋白标志物具有更好的诊断效果。HCCBloodTest目前已获得欧洲质量检测许可CE标志。与传统检测相比,“HCCBloodTest”可帮助肝硬化患者提前2个月查出肝癌。
HCCBloodTest的原理是采用实时定量PCR检测甲基化的Septin 9(SEPT9)。产品主要有三个试剂盒:Epi BiSKit – Plasma Kit (M7-01-001)、HCCBloodTest Sensitive PCR Kit (M8-001-002)和HCCBloodTest Control Kit (M8-001-003)。分别完成从血浆中提取和纯化的亚硫酸氢盐转化的DNA(bisDNA)、使用PCR检测SEPT9,以ACTB(β-肌动蛋白)DNA作为内部对照、并使用控制试剂盒验证整个实验过程。
有意思的是,HCCBloodTest并没有自己研发相应的仪器,而是适配了Thermo Fisher和Roche的产品。
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IvyGene
IvyGene是由美国Laboratory for Advanced Medicine公司开发,产品主要针对血液循环系统中的循环肿瘤DNA的甲基化进行检测,能够检测出I型乳腺癌,结肠癌,肝癌和肺癌。另一项针对肝癌的IvyGene liver test试剂盒在筛查肝癌患者时具有更好的检测效果。
IvyGene liver test试剂盒分析特定基因靶标的甲基化比率,以确认肝癌的存在。甲基化是一种表观遗传标记,可作为基因表达的指示剂和调节剂。本质上,通过识别哪些基因被打开或关闭,我们可以判断是否存在癌症,因此甲基化信息是作为癌症存在的一种可靠工具。与鉴定随机的基因突变对比,IvyGene分析特定基因的甲基化比率,以确认癌症的存在,减少分析的难度。通过AI和下一代测序技术(NGS)鉴定了这些基因靶标,该技术解码人类基因组以产生用于分析的特定基因靶标。在一项试验中,IvyGene liver test试剂盒对癌症和健康患者产生了80%的敏感性和86%的特异性。远高于其他常见的生物标志物,如AFP等。
目前,FDA已经通过了IvyGene的认证,但目前主要诊断肝癌的诊断。Laboratory for Advanced Medicine公司目前已通过分析超过10万份患者的血液标本,鉴别出了23种不同癌症的甲基化模式,其中包括早期检测乳腺癌,结肠直肠癌,肺癌和鼻咽癌检测,相信在不久的将来还会看到其更多试剂盒通过FDA认证。
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泛生子肝癌190基因检测
北京泛生子基因科技有限公司开发的肝癌190基因检测系统采用探针捕获技术,可提供血液和组织不同时期的分别检测或同一时期的配套检测。仅需1份样本,即可精准全面的提供肝癌靶向用药指导、化疗药物敏感性及毒副作用、免疫治疗指导、TMB肿瘤突变负荷评估;并提供预后判断、肿瘤复发、转移、耐药相关基因检测结果,帮助医生有效的实现结肝癌患者的全周期治疗指导和动态管理。具体检测参数如下图所示。
另一项报道技术是国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院与泛生子合作的HCCscreen,其主要采用cfDNA基因突变联合蛋白标志物的液体活检技术,成果发表在美国科学院院报PNAS上。
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