发表杂志：fronties in oncology
发表日期：09 August 2019
影响因子：4.28
博淼导读
选择这篇文献作为分享有2个原因，1）文章是今年8月份刚刚发表，代表最新的研究动态，想为老师新鲜奉上，2）文章的主要思路是使用公共数据库，先用45个TCGA数据库样本，分成CCA组和正常样本组，筛选差异，TCGA数据库的好处是它提供的样本是有临床信息的，再结合ILunima测序数据，确定差异，用GEO数据库中的芯片结果和163个TCGA样本验证找到的差异，最终确定miRNA、mRNA、lncRNA三者之间的用关系，并用Cytoscape构建PPI网络，呈现清晰的互作关系。整个实验设计简单，经典。将多个数据库的信息融合，用公共的数据做自己的研究，大大节约了科研成本。博淼生物在为客户服务的这10年间不断积累专业知识和服务经验，如果老师目前对自己的实验还没有太多思路或者想法不够细致完善，欢迎咨询我们，定制化方案+专业的服务+高性价比芯片产品，博淼生物为您科研服务保驾护航。
01
实验设计和策略
数据收集和预处理
从TCGA拿到CCA病人的临床信息和表达谱数据，取TCGA数据库中CCA（n = 45个）患者的表达数据，包括36个CCA肿瘤样品和9个非肿瘤样品。LncRNAs和mRNAs的定量基于GENCODE基因组研究项目（GRCh38）。总之，检索了来自RNA测序（RNA-Seq）的19,660个mRNA和1,4254个lncRNA以及来自miRNA-Seq的1,881个miRNA。测序数据是来自Illumina HiSeq RNA-Seq和Illumina HiSeq miRNA-Seq平台。另一个CCA患者队列包括163个样本（104个CCA样本和59个周围肝脏样本）从GEO数据库下载，登记号为GSE26566并且用于检查mRNA生物标志物的表达作为验证群组。此外，还从GEO数据库获得GSE89749（包括118个CCA样品）和GSE76297（包括91个CCA样品）的基因表达谱，以验证lncRNA和mRNA之间的关系。
构建
ceRNA网络miRcode数据库用于预测哪些DElncRNA和DEmiRNA可以相互作用。用三个数据库TargetScan，miRDB和miRTarBase来检索DEmiRNA靶向的DEmRNA，下一步是建立lncRNA-miRNAmRNA基于DElncRNA和DEmiRNA之间以及DEmiRNA和DEmRNA之间相互作用的ceRNA网络。
富集和功能分析
使用的是DAVID网站，KEGG pathway富集分析DEmRNA，P <0.05为显著。采用的是STRING网站来检索相互作用基因，构建DEmRNA的PPT网络（Cytoscape软件）来表现DEmRNA之间的相互作用。为了推断DEMRNA在ceRNA网络中的潜在功能，进行了DEmRNA的基因集富集分析（GSEA），将TCGA数据库中的35个CCA样品分为两组（高与低）。
生存分析和临床特征分析
我们进行了Kaplan–Meier生存分析，并讨论了ceRNA网络中DElncRNA，DEmiRNA和DEmRNA的表达与CCA患者的预后之间的关联。从TCGA数据库中提取临床信息，选择血管侵犯，组织学分级和肿瘤组织学分级等临床特征来分析这些特征与ceRNA之间的相关性。
02
实验结果与讨论
鉴别差异表达 lncRNA，miRNA和mRNA
差异表达分析是基于比较TCGA数据库中36个CCA和9个相邻正常肝组织样本中14,254个lncRNA，19,660个miRNA和1,881个mRNA的表达。使用FDR <0.05和| log FC | >1的标准，鉴定了在CCA和邻近的正常肝组织之间的1,410个DE1nRNA（916个上调和494个下调），64个DEmiRNA（34个上调和30个下调）和3,494个DEmRNA（2,184个上调和1,310个下调）。DE1ncRNA，DEmiRNA和DEmRNA的聚类分析和主成分分析表明，可以将CCA样品与正常样品区分开。
通过miRcode预测DelncRNA-DEmiRNA相互作用
使用miRcode数据库来预测miRNA靶向的lncRNA。构建的ceRNA网络仅包括DEmiRNA和DElncRNA之间的相互作用。因此，鉴定了117个DElncRNAs（AL591845.1，KIAA0087和H19等）与14个DEmiRNAs（hsa-mir-96，hsa-mir-182和hsa-mir-122等）之间的328个相互作用。
预测DEmiRNA靶向的DEmRNA
我们将上述14种DEmiRNA用TargetScan，miRDB和miRTarBase数据库搜索目DEmRNA。最后选择与所有3个数据集中的14个DEmiRNA中的13个相互作用的60个DEmRNA（表S4）。去除剩余的1个DEmiRNA和相应的lncRNA后，最终获得116个DElncRNA，13个DEmiRNA和60个DEmRNA以构建ceRNA网络，并计算每个基因的重要程度。KIAA0087（连接度= 8），hsa-mir-211（连接度= 50）和KIAA1549（连接度= 2）被认为是lncRNA，miRNA和mRNA中最重要的基因。由于hsa-mir-211是ceRNA网络中连接程度最高的基因（连接度= 50），我们认为它可能对CCA发病机制产生强烈影响。
功能富集分析与蛋白质-蛋白质相互作用网络构建
对ceRNA网络中60个DEmRNA做GO和KEGG途径富集。富集到15个GO Term和7 个KEGG途径。最显著的GO Terms是“序列特异性DNA结合”，“感觉器官发育”和“生长因子活性”。KEGG途径分析发现最重要途径是“内分泌抗性”，“雌激素信号传导途径”、“TNF信号传导途径”并构建了PPI网络 。
关键基因与总体生存之间的关联
我们对构建的ceRNA网络中的每个DElncRNA，DEmiRNA和DEmRNA进行Kaplan-Meier生存分析，以获得与CCA患者的预后密切相关的RNA。将26个DElncRNA，3个DEmiRNA和13个DEmRNA经鉴定为与总体存活相关的RNA。其中，17个DElncRNA，2个DEmiRNA和7个DEmRNA表现出保护功能，因为具有较高表达水平的这些RNA患者的预后比具有较低表达水平患者的预后长。 相比之下，剩余的9个DElncRNA，1个DEmiRNA和6个DEmRNA被认为风险性的，因为它们的表达与CCA患者的预后之间存在负相关。
ceRNA表达水平的正相关
根据ceRNA理论，lncRNAs可以通过竞争性地与miRNA结合位点结合，来正调节mRNA。为验证这一发现，在hl-mir-211靶向的DElncRNA和DEmRNA之间进行了回归分析，hsa-mir-211是ceRNA网络中连接程度最高的基因（连接度= 50）。在DE1ncRNA和由hsa-mir-211靶向的DEmRNA之间发现强正相关（相互作用得分的最小要求> 0.4）。 图5显示了相互作用的前三个相关系数，其中LINC00261与SLC43A1相互作用，HOTAIR与HOXC8相互作用，LINC00242在hsa-mir-211的调节下与ELOVL6相互作用。
DEmRNAs的GSEA富集
在对ceRNA网络中的DEmRNA做了GEO 数据库的验证之后，我们接着对鉴定了几个在TCGA中高表达的基因：即与SLC43A1，HOXC8和ELOVL6相关的生物途径，SLC43A1高表达组最显著富集在“帕金森氏病”; HOXC8高表达组最显著富集在“原发性免疫缺陷”; ELOVL6高表达组最显著地富集在“补体和凝血级联”。
证实lncRNA和mRNA之间的正相关
为了使我们的结果更可靠，还验证了其他独立数据集（GSE89749和GSE76297）中lncRNA和mRNA之间的关系。这两个数据集（GSE89749和GSE76297）的相关性分析结果与TCGA的结果一致。
此外，为了检查生物信息学结果的可信度，我们使用qPCR验证了SLC43A1的表达。来自11名CCA患者的qPCR结果与生物信息学结果一致。
ceRNA的临床特征分析
为了进一步研究ceRNAs，分析了参与ceRNA网络的ceRNA与TCGA数据库中血管侵袭，肿瘤组织学分级和病理分期等临床特征之间的相关性。结果显示3种miRNA和4种mRNA与血管侵犯有关; 7 个lncRNA，1个miRNA和3个mRNA与肿瘤组织学分级相关; 8个lncRNA，1个miRNA和4个mRNA与病理分期相关（P <0.05）。
讨论
从TCGA数据库获得36个CCA样品和9个正常样品的lncRNA，mRNA和miRNA表达数据。在综合整合36个CCA组织和9个正常组织的lncRNA，mRNA和miRNA表达数据的基础上，建立了与lncRNA相关的ceRNA网络，研究了ceRNA的调控机制。虽然CCA具有极其复杂的生物发生特征，但DEGs在很大程度上可以代表肿瘤发展和转移传播的复杂性; 因此，我们使用DEGs来建立ceRNA网络。发现与正常肝组织相比，CCA样本有1410个DElncRNAs，在ceRNA网络中有117个DElncRNA是靶向DEmiRNAs的。其中27个与总体生存明显相关。与非癌组织相比，CCA组织中有64个DEmiRNA，并且在ceRNA网络中有14个DEmiRNA被DElncRNA靶向。其中，3种DEmiRNA与总体存活率显着相关。与非癌组织相比我们发现3,494个DEmRNA，DEmiRNA靶向的60个DEmRNA包括在ceRNA网络中。其中，13种DEmiRNA与总体存活率显着相关。与总体存活相关的基因可能表明CCA的预后。使用GO和KEGG分析DEmRNA的功能和途径，发现主要富集在“序列特异性DNA结合”，“感觉器官发育”和“生长因子活性”以及“内分泌抗性”，“雌激素信号通路”和“TNF信号通路”等途径，与肿瘤发生密切相关。在ceRNA网络中，hsa-mir-211可与大多数DElncRNA和DEmRNA相互作用（连接度= 50），表明hsa-miR-211对CCA的发病机制和预后有显着影响。
博淼生物针对转录组的服务方面目前有多重服务可以选择：
lncRNA芯片平台
物种
芯片名称
芯片格式
芯片介绍
Agilent
芯片平台
人
Human LncRNA v6.0
4×180K
LncRNA79404条+mRNA37549条+circRNA21442条
小鼠
Mouse LncRNA v3.0
4×180K
LncRNA75005条+mRNA51691条+circRNA14761条
小鼠
SurePrint G3 Mouse Gene
8×60K
LncRNA16251条+mRNA39430条
大鼠
Rat lncRNA v2.0
8×60K
LncRNA10000条+mRNA30003条
拟南芥
Arabidopsis LncRNA v2.0
4×180K
LncRNA30000条+mRNA43603条
※ 注：更多物种/更多细分芯片请与博淼销售联系。
miRNA芯片平台
物种
芯片名称
芯片格式
芯片介绍
Agilent
芯片平台
人
Agilent Human miRNA v21.0
8x60K
可检测2549个人成熟miRNA
小鼠
Agilent Human miRNA v21.0
8x60K
可检测1881个小鼠成熟miRNA
大鼠
Agilent Human miRNA v21.0
8x60K
可检测758个大鼠成熟miRNA
※ 注：更多物种/更多细分芯片请与博淼销售联系。
mRNA芯片平台
物种
芯片名称
芯片介绍
Agilent
芯片平台
人
Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v2.0 Microarray 8x60K
该款芯片包含约26,083条Entrez Gene RNAs（unique）及30,606条lncRNAs（unique）
人
Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v3.0 Microarray 8x60K
该款芯片包含32,584条Entrez Gene RNAs及约12,000条lincRNAs。
小鼠
Agilent SurePrint G3 Mouse Gene Expression v2.0 Microarray 8x60K
该款芯片包含约27,122条Entrez Gene RNAs（unique）及4,578条具有相关研究信息的lncRNAs（unique）
小鼠
Agilent SurePrint G3 Mouse Gene Expression Microarray 8x60K
该款芯片除涵盖39,430条Entrez Gene RNAs外，更涵盖16,251条lincRNAs。
大鼠
Agilent SurePrint G3 Rat Gene Expression 8x60K Kit
该款芯片包含约30,584条Entrez Gene RNAs（unique）
※ 注：更多物种\更多细分芯片请与博淼销售联系。
博淼生物提供
小宇宙撰文
本文为博淼生物原创
