在寻找内源性细胞凋亡诱导因子时,作者发现E2以浓度依赖的方式诱导HeLa细胞死亡,且在E2处理24h后变化明显,36h达到起始水平的20%。同时,作者还检测了E2相关衍生物,包括雌酮(E1),雌三醇(E3),17-α-雌二醇和两种相关植物化合物(染料木黄酮和玉米赤霉烯酮),发现除E1之外,其它诱导细胞死亡的效果略低于E2,且均未诱导任何明显的细胞死亡。此外,还用类固醇激素如孕酮,睾酮和皮质酮处理HeLa细胞,发现孕酮诱导细胞死亡具有相似的效力,睾酮诱导细胞死亡降低,皮质酮具有甚至更低。为了验证E2诱导的细胞死亡的凋亡性质,作者进行了生化分析,发现caspase-3与caspase-7被激活,并且它们的底物聚(ADP-核糖)聚合酶PARP的剪切形式产生。这种E2诱导的caspase-3/7活化及其引发的PARP剪切可被caspase抑制剂z-VAD-FMK阻断。为了鉴定E2诱导细胞凋亡的途径,作者敲除HeLa细胞中的caspase-8,caspase-9和Apaf-1,并检测了细胞对E2的反应。在E2处理后,caspase-8的敲除不影响caspase-3活化或Cleaved-PARP的产生。然而,敲除caspase-9或Apaf-1完全阻止了caspase-3激活和Cleaved-PARP的产生,表明E2诱导的细胞凋亡是通过线粒体凋亡途径实现的。免疫荧光分析显示E2处理导致细胞色素c从线粒体释放到胞质溶胶中,更是证实了这一点。(图1)
为了更深入的阐明E2诱导的细胞凋亡的分子机制,作者分别敲除线粒体凋亡途径的成分Apaf-1、caspase-9和caspase-3,并检测细胞对E2的反应。敲除Apaf-1、caspase-9或caspase-3虽然都阻断了caspase-3底物PARP的剪切,但只能延缓并不能阻止E2诱导的细胞活力丧失,且未见凋亡小体形成,而这与caspase抑制剂z-VAD-FMK类似。因此,一旦线粒体凋亡途径被激活,抑制caspase活性并不能改变凋亡细胞的命运,而只是改变了死亡的形态。为了验证这一点,作者又对Bax或Bak敲除以及两种基因同时敲除,结果显示Bax和Bak的双重敲除与阻断caspase激活类似,延迟了细胞死亡,而Bax和Bak的单敲除并没有改变E2诱导的细胞死亡。单独敲除Bax或Bak都不能阻止caspase-3的激活和Cleaved-PARP的产生,但当敲除Bax和Bak时,并没有看到caspase-3的激活和Cleaved-PARP的产生,只是细胞死亡形态发生了变化,即从典型的凋亡转变为浓缩细胞质中异质小泡的积累,且阻断了下游caspase的活化,这表明线粒体凋亡途径确实是由E2通过Bax和Bak激活的,并与观察到的凋亡形态有关。此外,检测包括Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1在内的抗凋亡蛋白水平时,发现E2处理细胞24小时后,Bcl-2和Mcl-1蛋白水平显著下降,而caspase抑制剂也无法阻止。而过表达Bcl-2、Bcl-XL或Mcl-1,阻断了E2诱导的细胞凋亡,与Bax和Bak双敲除细胞相似,这些抗凋亡蛋白的过表达只改变了死亡细胞的形态,而没有改变细胞的命运(图2)。综上, E2诱导的细胞死亡是通过下调Bcl-2和Mcl-1的线粒体凋亡途径完成的,但细胞的命运是由这些抗凋亡蛋白上游的事件决定的。
为了研究E2诱导凋亡的线粒体上游分子事件,作者通过化合物文库筛选出了西洛他唑(Cilo),它能够剂量依赖地阻断E2诱导的细胞死亡。Cilo是一种喹诺酮类衍生物化合物,选择性抑制磷酸二酯酶3型(PDE3)。PDE3强抑制剂trequinsin(Treq)处理进一步证实PDE3抑制剂具有抑制E2诱导细胞凋亡的能力。哺乳动物PDE3家族由PDE3A和PDE3B两个成员组成,而PDE3A敲除对细胞对E2处理更具耐药性。为了证实Cilo和Treq是通过破坏PDE3A的功能发挥作用的,作者敲除HeLa细胞的PDE3A,发现这些细胞对E2没有反应,这表明E2诱导的凋亡需要PDE3A。构建PDE3A不同突变体进行过表达实验,证明对E2诱导的细胞凋亡起作用的是PDE3A本身,而不是其酶活性。此外,EKVX和MCF7细胞敲除PDE3A,然后经由E2与PDE3A抑制剂共处理后,细胞死亡均消失(图3)。综上,E2通过PDE3A介导细胞凋亡。
为了进一步探讨PDE3A如何诱导细胞死亡,作者通过引导RNA(gRNA)定向筛选出Schlafen12(SLFN12),并将其敲除,发现SLFN12敲除再用E2处理并不诱导细胞凋亡,而将SLFN12的cDNA导入这些敲除细胞,能挽救对E2诱导细胞凋亡的敏感性,这说明E2诱导的细胞凋亡需要SLFN12。PDE3A或SLFN12敲除能抑制孕酮、睾酮和皮质酮处理诱导的细胞凋亡,在E2处理后并不引起caspase-3,caspase-7与caspase-9的活化,也不会导致PARP的剪切,同时也不降低Bcl-2或Mcl-1蛋白的水平(图4)。这些结果表明PDE3A和SLFN12在E2诱导的凋亡中作用于Bcl-2家族的上游,与Bax和Bak不同的是,缺乏PDE3A或SLFN12的细胞能抵抗E2引起的凋亡。
细胞经E2处理后PDE3A才与SLFN12共沉淀,Cilo或Treq共处理完全阻断了SLFN12与PDE3A的相互作用,说明这种相互作用仅发生在E2诱导凋亡后。WB实验显示,E2处理后SLFN12-Flag融合蛋白水平高于DMSO处理对照细胞或用E2和PDE3A抑制剂Cilo或Treq共处理的细胞,这表明在E2处理后,SLFN12通过与PDE3A的直接相互作用稳定其蛋白。然后,检测E2处理后SLFN12-Flag蛋白的水平,发现SLFN12-Flag蛋白水平呈时间依赖性上升,进一步的实验证实SLFN12蛋白水平的增加与E2诱导的PDE3A-SLFN12相互作用有关。蛋白酶体抑制剂bortezomib与E2共处理实验,证实PDE3A-SLFN12相互作用可以阻止SLFN12的泛素化降解。(图5)
SLFN12蛋白以依赖PDE3A的方式稳定其蛋白,这提示SLFN12蛋白只有在超过一定阈值水平时才会引起凋亡。为了验证这一点,作者构建了SLFN12敲除细胞株,并转染强力霉素(Dox)诱导表达SLFN12的质粒,在Dox和E2的处理下,SLFN12表达,细胞死亡。有趣的是,这种SLFN12表达诱导的细胞死亡发生在PDE3A抑制剂Cilo存在的情况下(图5I),这表明是SFLN12蛋白而不是PDE3A,导致细胞死亡。此外,SLFN12突变蛋白K213R在E2处理后仍能与PDE3A相互作用,但丢失了诱导凋亡的活性(图5H)。为了探讨升高的SFLN12如何诱导细胞凋亡,作者在SFLN12-/-HeLa细胞系,过表达SFLN12-Flag/HA(WT)与凋亡缺陷型SFLN12突变体(K213R),发现与SLFN12(K213R)相比,SLFN12(WT)显著富集的9种蛋白都是核糖体成分,这些核糖体蛋白与SLFN12(WT)相关,并对其中三种进行WB验证,证实核糖体蛋白RPS27A、RPS6和RPL7A与SLFN12(WT)相关,而与SLFN12(K213R)无关。此外,这种相关性发在E2处理的细胞,caspase抑制剂z-VAD-fmk并不影响SLFN12 (WT)和这些核糖体蛋白之间的结合。为了探究这些核糖体蛋白与SLFN12的关联是否依赖于完整的核糖体,作者用RNaseA处理细胞裂解物来破坏核糖体,发现确实消除了这种关联,这说明PDE3A-SLFN12相互作用是SLFN12与核糖体结合前的上游事件。进一步实验分析,证实细胞中升高的SLFN12与核糖体结合,以防止SRPs招募,阻断蛋白在ER的翻译。
虽然观察到E2诱导的细胞凋亡很强烈,但其所需的雌激素及相关激素远高于人血清浓度。然而,在胎盘等产生激素的局部环境中,雌激素和孕酮的水平远远高于诱导细胞凋亡的浓度。有趣的是,部分胎盘绒毛滋养层细胞在胎盘发育过程中表现出凋亡的迹象,包括caspase-3的活化、PARP的剪切和DNA的破碎。此外,还在合体滋养层细胞中检测到凋亡标记物。因此,作者对自然流产的胎盘进行分析,以探究合体滋养层细胞的凋亡是否由SLFN12介导。结果显示,PDE3A在子宫内膜组织和胎盘中均有表达,但SLFN12信号在合胞芽和绒毛状合胞滋养细胞中都检测到,而子宫内膜和内侧增殖的单核滋养层细胞中均未见。进一步的免疫荧光分析,SLFN12信号分布在多核合胞芽和合体滋养层,且与活化的caspase-3信号共定。此外,作者还用滋养层细胞系HTR-8/SVneo来检测其对E2的反应,证实滋养层细胞凋亡确实是由PDE3A和SLFN12介导的。
生命树之谜:
中国科学院动物研究所生殖病理学研究组
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