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协和论文拾粹--211
本期介绍北京协和医院肝脏外科赵海涛教授团队于2019年3月发表于Web of Science数据库Q1区杂志“Journal of Cellular Physiology”上的文章“Comprehensive analysis of a ceRNA network reveals potential prognostic cytoplasmic lncRNAs involved in HCC progression”
影响因子“4.522”
整合分析ceRNA网络呈现的细胞质内与肝癌进展相关的潜在预后lncRNA
作者：白易，龙俊宇，刘之松，林健振，黄晗春，王东旭，杨旭，苗菲，毛一雷，桑新亭，赵海涛
研究背景及目的
长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNA）是一类长达大于200nt且没有编码能力的特殊RNA，其异常表达在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）生物学领域引起越来越多的关注。细胞质是lncRNA发挥竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）功能的主要场所，由于lncRNA具有高度的组织特异性和亚细胞定位特点。
本研究基于lncRNA核质定位继而构建ceRNA网络的方法不仅缩小了目标lncRNA的范围，且为评估HCC的预后提供了高度特异的候选分子生物标志物，加深对HCC早期发展过程中所涉及的ceRNA网络的认知和理解。
方法
本研究首先获取了来自癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）的371个HCC组织和50个正常组织中的lncRNA，微小RNA（microRNA，miRNA）和信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表达谱，并鉴定了肝癌发生特异性差异表达基因 (log fold change ≥ 2, FDR＜0.01)。
因为lncRNA的特定功能与其细胞内定位密切相关，且细胞质是ceRNA作用的主要场所，故团队继而分析了这些差异基因之间的相互作用，并分析了lncRNA的细胞内分布。
在排除了仅位于细胞核中的lncRNA后，构建了由37个lncRNA，10个miRNA和26个mRNA组成的HCC早期进展相关的ceRNA网络。
进一步对该网络进行生存分析发现15个lncRNA，3个miRNA和16个mRNA与HCC患者的总体存活率显着相关（p <0.01）。
此外通过多元Cox回归和lasso分析，构建了一个基于13个lncRNA的风险评分系统，对HCC患者的预后具有很好的判别和预测能力。
主要结果
（1）
根据样品病理类型进行了分组：正常对照组（n=50），G1-G2组（n=233），G3-G4组（n=136）。利用edgeR包（log fold change ≥ 2，FDR＜0.01）两两比较获取差异表达的lncRNA，miRNA和mRNA。随后通过miRcode数据库首先确认上述lncRNA和miRNA之间的关系，再利用miRDB，miRTarBase和TargetScan三个数据库确定上述miRNA和mRNA之间的关系。
图1：鉴定差异基因。
两组之间异常表达的lncRNA（上图），miRNA（中图）和mRNA（下图）的火山图：正常样品与G1-G2期HCC样品（a）; 正常样品与G3-G4期HCC样品（b）。其中红点定义为上调基因，绿点定义为下调基因。维恩图表示差异表达基因的交叉点（c）。紫色区域来自左侧火山地图，黄色区域来自右侧火山地图。
（2）随后利用lncATLAS数据库对经上述过程筛选后的53条lncRNA进行细胞内定位分析，排除了13条只位于细胞核内的lncRNA之后，再考虑lncRNA-miRNA-mNRA互作关系，最终保留了37条lncRNA，10条miRNA和26条mRNA构建了ceRNA网络。并对其中的26条mRNA进行了GO和KEGG分析。
图2：ceRNA网络的整合分析。
差异lncRNA的亚细胞定位（a）。红色八边形代表53个差异1ncRNA（黄色圆圈）的细胞内分布（细胞核;细胞质;细胞核和细胞质均存在;无数据）。ceRNA网络（b）。蓝色圆圈代表37个lncRNA; 红色方块代表10种miRNA; 黄色三角代表26个mRNA。和弦图显示了26个差异mRNA的五个显着富集的GO（c）。差异mRNA与8条信号传导途径相关（d）。
（3）对ceRNA网络相关的RNA进行生存分析发现15条lncRNA与预后相关，经过Lasso和Cox回归分析降维后保留13条lncRNA构建了风险评分系统，发现其能更好对患者生存时间进行预测并判断患者预后。
图3：风险评分系统。
对15条差异lncRNA进行Lasso和Cox回归分析。不同惩罚水平的系数值（a）。每条曲线代表不同的lncRNA。使用十倍交叉验证来计算最佳λ值及对应的最小平均交叉验证误差（b）。基于风险评分选择最佳截止和生存曲线。风险评分相关的标准化对数排名统计数据显示在（c）中。最大统计量被定义为最佳截止值。低风险和高风险评分HCC患者的密度分布见（d）。两组的Kaplan-Meier生存曲线显示在（e）中。基于风险评分水平的时间依赖性ROC曲线显示在（f）中。13条差异lncRNA的风险评分分析（g）。上方散点图显示了13条差异lncRNA的风险评分，下方热图展现了具有存活数据的每个HCC患者中的差异1ncRNA表达谱。
（4）最后对ceRNA网络中的lncRNA和mRNA进行了相关性分析，将存在相关性的lncRNA和mRNA进行了可视化，并进一步缩小了lncRNA-miRNA-mRNA作用轴作为潜在研究对象。
图4：lncRNA与mRNA相关性分析。
存在相关性的LncRNA与mRNA（n = 370）展示（a），鉴定的lncRNA-miRNA-mRNA模块图（b）。
结论
根据lncRNA的亚细胞分布和基因间的相互作用，提出了一种lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络的新构建策略。除提供全面的分析网络外，该方法还缩小了目的lncRNA的研究范围，提高了其预测准确性，对于作为HCC患者诊断，预后和治疗靶点的候选生物标志物具有临床转化潜力。
评 论
肝癌是世界上第六大常见恶性肿瘤，目前是肿瘤相关死亡的第二常见原因。
根据美国2018年的流行病学数据，2011年至2015年，女性肝癌患者死亡率每年增加2.7％，男性每年增加1.6％。
鉴于早期HCC缺乏特异性临床表现，70-80％的患者在出现症状时已经处于晚期错过了接受根治性切除的机会。
此外，尽管HCC治疗方法的发展取得了很大进展，包括放疗，化疗，经导管动脉化疗栓塞治疗，射频消融，靶向治疗和免疫治疗，其根治术后5年生存率仅减少1-3％，而术后5年复发率可达70％。值得注意的是，未接受治疗的晚期肝癌患者的中位生存时间仅为7.1个月。
因此，确定HCC的发病，发展和转移的分子机制对于早期的诊断，治疗方法的选择，随访时间的确定以及预后的评估至关重要，可以帮助提高患者预期寿命和增加临床获益。
作为不具有蛋白质编码能力的非编码RNA，lncRNA最初被认为是转录噪声。然而，越来越多的证据表明，lncRNA的差异表达通过剂量补偿，表观遗传调控，细胞周期调控和细胞分化调节在肝癌发生，血管侵犯和远处转移中起关键作用。lncRNA的长度通常超过200个核苷酸，并且由于其进化的非保守特征，其表现出较miRNA和mRNA更大的物种，组织和细胞特异性。此外，lncRNA基于其亚细胞定位执行不同的调节功能。通常，在细胞核中，lncRNA主要在染色质调节，转录调节和可变剪接调节中起作用。而在细胞质中，lncRNA主要通过竞争性内源RNA（ceRNA）调节机制吸附miRNA影响其靶向的mRNA稳定性。
TCGA平台是一个开源测序数据库，涵盖30多种人类癌症类型，包含临床病理学信息和相应的生物信息学数据。该数据库是生物发现和数据挖掘的理想资源，已针对大多数肿瘤类型构建了ceRNA网络，例如头颈部鳞状细胞癌，胃癌和皮肤黑素瘤。这些网络有助于深入了解复杂的基因相互作用，并有助于识别癌症诊断，治疗和预后的潜在生物标志物。
本研究分别比较了 G1 / G2期HCC组织和正常组织以及G3和G4和正常组织之间差异表达的lncRNA，miRNA和mRNA。随后基于miRcode，TargetScan，miRDB和miRTarBase数据库确定lncRNA-miRNA-mRNA假定的相互作用。通过lncATLAS数据库去除核定位lncRNA后，选择了37个lncRNA，10个miRNA和26个mRNA来构建与HCC发生相关的ceRNA网络。最后，在lasso惩罚的Cox回归分析后，使用显著影响HCC患者预后的13种lncRNA来建立风险评分系统。
这种考虑lncRNA细胞内定位的新型ceRNA网络构建方法将有助于筛选具有更窄范围和更高准确度的HCC相关ceRNA中的重要基因。
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