供稿：体外诊断学院
导读：本文旨在帮助同行伙伴们，深度理解和学习什么是基因测序？他的市场应用是什么？因为，关于基因测序的文章和资讯很多，但是很多都是长篇大论或者片面化分享，我们希望通过专业并结合通俗、精炼的文字进行分享，帮助大家对基因测序形成清晰的认识！
基因测序的技术原理解读
开始话题之前，我们有必要和大家区分两个关键概念性问题。
一个关键问题是上次文章发表我们讲到的核酸检测技术（也就是我们常说的以核酸扩增为基础的PCR技术）和基因测序技术有什么相同和不同之处？简单来讲，相同之处：核酸检测技术和基因测序技术、FLSH技术都属于基因检测技术范畴。
另一个关键问题是核酸检测和基因测序应用（研究）对象的问题，不同之处：核酸检测技术研究的对象是核酸【也就是我们常说的DNA/RNA】，基因测序技术研究的对象是基因（专业叫：遗传因子，可以理解为基因是有遗传效应的某段DNA片段）。因此，基因和核酸（DNA/RNA）是完全不同的概念。有区别又有联系，简单理解的话，假如说DNA是一本书，那书中的关键性文字片段就是基因。
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目前遗传信息的测序分析只能通过测序反应来实现，这也是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段。关于基因测序的原理，我们分三部分来讲解：第1代测序、第2代测序、第3代测序。
（一）第1代测序原理
1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。
Sanger 测序法是第一代基因测序的基本原理，Sanger本人也获得了诺贝尔化学奖。2001年完成的人类基因组框图，采用的也是Sanger法。Sanger法直到今天还在广泛使用，准确率高，被称为基因检测的金标准。所以，要了解DNA测序，首先要了解Sanger法。在这里，我并不涉及具体的化学方程式和公式，只讲原理。
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首先，将待测序的DNA进行扩增，就是复制出很多相同的DNA，准备足够的样本量。接下来，通过加热使DNA变性。双链DNA就分离开来，成为单链DNA，称为模板链。然后将测序引物和模板链结合，同时将添加完测序引物的DNA平均分散在四个反应容器中。为什么是4个？因为DNA由4个碱基组成，分别是A\T\G\C。测定过程中，将待测样品（待测序列的单链DNA）分为4份，每份改变一种脱氧核苷酸（如将A改成ddA），则在复制过程中将会在原来A的位置终止复制，这样在复制结束后，第一份样品中所有片段全是以ddA为终端的不同长度的序列，以此类推，第二份样品以ddT为终端……这就形成了长度不同，但终端已知的DNA序列。通过电泳法分辨出长短不同的序列，再看看序列对应的添加材料是哪一种，就能按照序列的长短来确定相应的脱氧核苷酸位置，从而确定待测分子的DNA序列。
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关于第一代测序技术：Sanger 测序法，如果觉得很复杂，可以通过下面的视频进行深入学习：
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（二）第2代测序原理
“边合成边测序”，以待测序列为模板，按照碱基互补配对原则进行合成，每新加一个碱基就进行一次扫描，读出这个碱基（利用Sanger法读出），最终获得完整的DNA序列。该技术出现于2000年左右，通量大幅提升，读长较短，可一次并行测定几十万到几百万条DNA序列，目前应用范围相对广泛。
（三）第3代测序原理
基于纳米孔的单分子读取技术：在纳米孔测序技术中，DNA分子依靠核酸外切酶以一次一个碱基的速度通过小孔，这个酶能清楚地区分出4个DNA碱基编码：A、C、G、T，也可以检测出该碱基是否被甲基化，一个单孔能在大约70天左右测定一个完整的基因序列。该技术出现于2008年前后，读长优于二代测序，无须对样本进行扩增，但目前测序成本高，准确率较差，还未获大规模商业推广。
基因测序技术发展至今，经历了三次演变，每一代测序技术都各有优劣势，彼此之间互为补充，而不是相互替代。二代测序技术是目前应用最广的技术，三代测序技术目前用于科学研究中。
基因测序的市场应用
关于基因测序技术的市场应用场景，大致可以分为：科研级、临床级、消费级应用。科研级应用面向科研机构、高等院校和药企。临床级应用面向患者，检测结果具有临床意义，可作为医生诊断、治疗依据。消费级应用面向普通消费者，包括皮肤检测等。其中临床级目前应用范围最广、商业价值最大，我们主要也是具体讲讲临床应用这块。而关于三大应用场景知识图谱，可以参照下图所示：
数据来源于：鲸准数据
关于基因测序技术的临床应用，我们主要分下面几块来分享：一代测序技术应用、二代测序技术应用、三代测序技术应用。
Sanger测序在我国临床应用较少，但它仍以其独特优势稳坐“国际金标准”宝座。然而受限于通量低的特点，Sanger测序目前多用于少量DNA分子测序实验中。如我们常使用的对质粒、PCR产物、单基因突变进行序列分析。
Sanger测序（一代测序）技术对国外的临床应用主要有两个途径：商业化检测试剂盒的应用和CAP认证的独立实验室进行相关项目检测，例如：HIV耐药突发检测试剂盒的商业化。
NGS高通量测序的临床应用范围很广，主要分为以下几大类：
1）肿瘤分子诊断个体化用药
2015年3月27日，国家卫计委医政医管局发布第一批肿瘤诊断与治疗项目高通量基因测序技术临床试点单位名单。以下是hsmap显示的相关信息：
数据来源：火石创造
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