【案例分享】Duchenne肌营养不良

疾病概述

Duchenne肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是最常见的X连锁先天性肌病，发病率约1/3800~1/6000（活产男婴）。DMD患儿出生时无症状，因此早期诊断困难，患者常在 3～5岁时出现运动迟缓、步态异常、站立困难等症状，约12岁时就需要依赖轮椅出行，20岁左右可能因心肺功能衰竭而死亡。其病因是编码抗肌萎缩蛋白基因突变，导致抗肌萎缩蛋白功能缺陷，最终造成肌肉组织发生炎性损伤，肌肉组织变性、坏死，脂肪及结缔组织增生。

发病机制

 Duchenne肌营养不良是由编码Dystrophin的基因（DMD）突变所致，DMD基因位于X染色体的短臂，约2.4Mbp ，共有79个外显子。Dystrophin蛋白位于肌细胞膜内侧面，N末端连接在肌动蛋白上，C末端连接肌细胞膜上Dystrophin相关糖蛋白，组成肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DGC)。 N末端和C末端之间是中心杆区域，24个重复的血影蛋白样结构，其中分散穿插4个铰链域。 DGC类似一个跨膜平台将细胞外基质(ECM)锚定到细胞内细胞骨架上，使肌肉纤维更能抵抗损伤，同时有助于将收缩力从肌节传递到ECM。DMD患者 Dystrophin异常导致DGC功能障碍，使肌肉收缩时肌纤维膜和细胞骨架连接容易被破坏，结缔组织和脂肪浸润，呈现假性肌肥大及肌萎缩。

DMD基因突变类型复杂，目前已知7000种突变与DMD发病相关。约12%-33% 的DMD患者属于新生突变，评估突变类型的变异，发现69%DMD患者属于大片段缺失，11% 为大片段重复，10%为无义突变，7%为错义或小的插入、删除突变，另外3%患者有内含子或其他突变。

Monaco研究小组提出中心杆区域缺失，若还能保留阅读框，可能导致症状比较缓和的BMD ，但是若缺失导致整个阅读框破坏而不能延续，将导致严重的DMD 。BMD发病率比DMD发病率低，约占DMD患者的10%。BMD同样属于X-连锁隐性遗传，临床特点与DMD类似，但程度较轻，如腓肠肌肥大、近端肢无力、极高血清肌酸激酶等。

临床表现

DMD主要表现为进行性对称性骨骼肌无力和萎缩，通常男性发病。全世界新生男婴的发病率1/3600 ，患儿出生时常无症状，发病隐匿，大部分患儿 坐立时间发育正常。DMD患儿首先出现的症状多为行走缓慢，随后出现四肢近端、躯干和骨盆带肌肉无力、肌张力低，蹲起和上楼困难，因盆带肌无力走路时腰椎前突并呈典型鸭步步态。

随着患儿年龄的增加病程进展，髋关节、膝关节、跟腱等最先出现挛缩，后期累及肘和躯干肌；当椎旁肌无力不能控制身体时可出现脊柱侧弯，坐姿异常，进而引起呼吸功能不全，DMD患儿多于9-12岁逐渐行走不能，脊柱侧弯与行走能力丧失时间上密切相关，因此提倡早期手术治疗脊柱侧弯，推迟脊柱侧弯出现时间，同时可增加用力肺活量（FVC），但对预期生存期并无显著影响，20-30岁时多因心肺衰竭死亡。

DMD突变基因女性携带者，90%以上为表型正常，仅表现为血清肌酶轻到 中度升高，少数可有DMD症状（例如X染色体失活或者X染色体与常染色体发生平衡易位导致）。发病年龄也由幼年到成年后的40或50岁，临床表现可轻重不等，从一般的肌痛、痉挛到严重的肌无力均可出现，一小部分合并扩张型心肌病。

流行病学和临床观察均发现，DMD除骨骼肌受累外，还常常合并心脏损害。骨骼肌和心肌细胞膜上均表达Dystrophin 蛋白，是DMD心脏损害的病理生理基础。心肌病理改变也与骨骼肌类似，常见间质炎症，脂肪和间质纤维化。约90%的DMD患者合并心血管疾病，而且最终有高达20%的患者死于循环衰竭。同时 Dystrophin基因是家族性扩张型心肌病的致病基因之一，其突变可以导致X连锁扩张型心肌病。

基因诊断

 由于70% 的 DMD 患者的基因变异形式为基因单外显子或多外显子缺失或复制突变，所以基因检测时应将DMD基因缺失和重复次数测试作为第一步确认测试。多重PCR只能识别缺失，应选择多重连接依赖性探针扩增(MLPA)或比较基因组杂交阵列方法检测。这两种方法还可以预测临界突变是否保留或破坏外显子阅读框。如果这两种方法检测结果是阴性，可选择基因测序，以寻找另外30%左右的可能的DMD基因的点突变。这部分突变包括点突变（无意义或错义），小缺失，以及小的重复或插入，可以使用二代测序进行识别。DMD患者的家庭成员应该接受基因咨询，识别哪一个是突变携带者，尤其是患者的女性亲属。近年来，随着基因诊断技术的发展，女性携带者可以通过产前诊断或胚胎植入前诊断来避免疾病在家庭中再次出现患者。

治疗策略

01

基因替代治疗

基因替代疗法可用于治疗所有 DMD 患者，但由于DMD基因及其 cDNA序列很长，直接的全基因替代疗法很难实施。对DMD的治疗来说，必须将基因广泛且有效的传递到患者所有肌肉组织中。腺相关病毒(AAV)载体就具备这样的传递能力，但受到其克隆容量的限制，无法将内源性的DMD基因整体传递。2006 年，6 例DMD男性患儿接受了首次基因疗法临床试验，但最终因无法在患者体内检测到转入基因的表达，且患者体内产生了对Dystrophin蛋白严重的免疫反应而宣告失败。在治疗前后都能检测到对Dystrophin蛋白特异的T细胞，说明T细胞免疫应答在治疗过程中具有重要作用，同时也说明在选择受试患者时对Dystrophin蛋白免疫反应筛查的重要性。

02

外显子跳跃

在DMD各种类型的突变中，单个或多个外显子缺失或框移突变患者占大多数，这些突变破坏了mRNA 开放阅读框并干扰了功能性Dystrophin蛋白的合成。采用修饰和补充RNA或 DNA 寡核苷酸(AON)来反义调控外显子跳跃能调节 Dystrophin前体mRNA 的剪接，恢复阅读框并产生具有部分功能的Dystrophin蛋白。外显子跳跃治疗策略的局限性在于它们只针对特定外显子跳跃突变有用，因而只对一部分患者有疗效。例如外显子 51 发生突变的患者占患者总数的 13%。因此，多重外显子跳读(外显子 45-55)治疗策略在理论上有一定的可行性，且有研究者认为这种策略理论上能够针对 63%的 DMD患者，但多重外显子跳读有稳定性差和疗效偏低等缺点，因此目前还处于临床前试验阶段。

03

CRISPR/Cas9系统

CRISPR/Cas9系统是近年来非常热门的基因编辑技术，它通过 gRNA 锁定目标DNA序列并用Cas9核酸酶使其双链断开，之后通过非同源末端连接对DNA进行修复，从而完成对目的基因的改造。这种方法被证实在DMD 模型动物的生殖细胞、DMD患者的成肌细胞 以及诱导多能干细胞中能够纠正DMD基因突变，且能够减缓DMD模型动物的病程 。但 CRISPR/Cas9 系统所编辑的基因产物仍然存在机体免疫应答不佳的潜在问题。另外，脱靶效应也是该技术需要解决的重要问题。

案例分享

受检者（先证者），男，送检时4岁，发现CK高4个月，CK值：3000-4000m/l，临床上北京儿童医院的医生高度怀疑是DMD患者，送检我们康旭医学检测所，同时母亲的血样做验证，检测项目是：遗传性肌肉病检测包（包含MLPA：DMD），检测结果发现受检者和母亲DMD 基因45-47号外显子缺失变异；2019年先证者母亲再次怀孕早期，取绒毛DNA做验证，结果发现绒毛DNA中DMD基因45-47号外显子缺失变异。

先证者检测结果:DMD基因45-47号外显子缺失变异

先证者之母检测结果:DMD基因45-47号外显子杂合缺失变异

先证者之母之绒毛DNA检测结果:DMD基因45-47号外显子缺失变异