关于FFPE你了解它多少：从制备，测序到分析

问：我有一些FFPE样本想要进行测序，不知道你们的技术能不能适用啊？

小艾：可以的，现在FFPE样本已经广泛应用到了捕获测序领域。

问：你们的技术对于FFPE样本有什么要求啊？

小艾：没有特别需要注意的要求，主要还是看样本提取出来后的一个DNA质量。

问：FFPE样本的数据表现怎么样啊？

小艾：这个没有一个确定的指标，因为FFPE样本的DNA质量各种各样，而最终数据表现主要取决于样本自身质量~~~

高通量测序中常遇到的样本类型有Genomic DNA、FFPE Genomic DNA、cfDNA，小艾在前期已经和大家介绍了网红cfDNA的基本知识，本期来和大家分享另一网红FFPE样本的基本知识。

一

FFPE样本的定义

FFPE（Formalin-fixed paraffin-embedding），通常指人的或者动植物组织样本利用福尔马林固定、石蜡包埋形成的石蜡切片或者石蜡块样本，是医学领域常见的生物材料。这一保存方法是目前用于长期保存病理样本的标准化方法，可以保存临床上大量的患病组织。此类样本已经被广泛应用于高通量测序、原位杂交、免疫组织化学等研究领域。

二

FFPE样本的制作

1. 样本采集：

为了避免组织取下来之后在外界环境中可能发生的基因表达改变、组织自溶等变化，组织从获取到固定之间间隔的时间越短越好。

2. 福尔马林固定：

组织的固定使用的是福尔马林溶液。将组织放到一定浓度的福尔马林溶液中，使核酸之间、蛋白质之间、核酸和蛋白质之间发生一定程度的交联，这个过程中需注意把握组织的厚度、固定时间、福尔马林与组织的比例（一般是10:1）。

3. 石蜡包埋：

固定之后，需要用石蜡将组织进行包埋。包括四个基本步骤：a)脱水，使用醇类替换掉水；b)透明，二甲苯或二甲苯替代物替换掉醇类；c)浸蜡，石蜡替换掉二甲苯；d)包埋，整个标本用石蜡包围。

三

FFPE样本的提取和DNA品质

一次测序结果的好坏，最重要的影响因素就是DNA的品质，FFPE样本的DNA品质会显著影响后续二代测序文库的构建成功率和测序数据指标。所以从FFPE样本中提取出高质量的DNA，尤为重要。

通常，FFPE样本核酸提取实验包括以下流程：脱蜡和水化、酶消化组织、解交联、核酸提取。

1. 因为FFPE样本的特殊性，所以在处理样本的时候第一步先要进行脱蜡，原因是石蜡会阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K和组织内蛋白的接触。这会影响到组织消化和核酸的释放。目前常用的是有机溶剂脱蜡法。需注意，脱蜡一定要彻底。

2. 利用蛋白酶K消化蛋白质以及样品中可能存在的任何核酸酶。注意要把握好消化时间，可以根据组织类型、组织大小进行调节，使DNA充分释放。

3. FFPE样本中核酸和蛋白质是紧密交联在一起的，消化后样本处于水化状态，此时需要进行震荡解交联，释放DNA。

4. 接下来根据不同的研究目的选取相应的方法提取DNA。常用的有酚氯仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等。

FFPE样本提取出来的DNA质量一般都比较差，主要体现在以下方面：DNA总量少、存在不同程度的降解、存在C>T/G>A等碱基替换造成检测结果的假阳性等。如下表所示是影响FFPE样本DNA质量的一些因素和导致的后果：

四

FFPE样本的二代建库注意细节

1. 对FFPE样本提取出来的DNA进行质控

在建库前需要先对DNA进行质检，主要检测DNA的总量（浓度）、完整性以及纯度。用Qubit^®3.0进行浓度的测定，用电泳检测DNA是否有降解，检测OD260/OD280、OD260/OD230判断是否有蛋白质、RNA、碳水化合物等杂质污染。DNA的建库起始投入量不足、DNA有降解、存在杂质污染等这些因素会影响建库的成功率以及后续测序数据的表现。所以，浓度测定一定要准确，目的是保证建库投入量的准确性，我们推荐用Qubit^®3.0进行浓度的测定。电泳检测DNA如果有降解的话，需要根据降解程度来适当调整后续DNA的打断时间。如果存在蛋白质、RNA等杂质污染的话，需要用蛋白酶K、RNA酶等进行消化、纯化处理。目的都是为了在建库前了解DNA的质量，一方面可以提前采取措施提高建库的成功率，另一方面当后续实验或者测序数据指标出现问题时可以更好的追溯原因。

2. FFPE样本提取出来的DNA在打断前进行损伤修复

FFPE样本在制备和保存过程中会使得基因组DNA发生一定程度的损伤，比如缺口、胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶等，为了提高文库质量，建议将DNA先用特定的酶混合物进行修复，然后再进行打断。艾吉泰康在处理客户样本时，使用NEBNext^®FFPE DNA Repair Mix（货号M6630）进行DNA的修复。

3. 打断时间

二代建库的初始需要对DNA进行打断，使其片段化。FFPE样本由于保存环境以及时间的不同，提取出来的DNA会发生不同程度的降解，所以在打断的时候，打断循环数（也就是打断时间）需要根据DNA的降解程度进行调整，使打断后片段峰值尽量集中在预期的范围之内。针对PE150测序策略，我们建议打断后片段峰值集中在150-200 bp之间。如果片段峰值偏大，可以继续进行打断。如果片段峰值偏小，可以重新取样打断，也可以继续后续实验，但是这样测序的时候会多测到一些接头序列，会造成数据量的浪费。

五

FFPE样本的数据表现

来自于FFPE样本的DNA通常存在总量不足、降解问题，这会影响有效模板量。有效模板量降低，即文库的有效库容减少，会影响目标区域的覆盖度、均一性以及冗余度。根据艾吉泰康的项目经验，在DNA建库投入量加倍的情况下，最终的数据表现，仍然会有均一性下降、捕获效率降低的情况。但这种情况并不是100%出现，仍有部分样本有足够优秀的数据表现。