大家好,今天带来的一篇文章是发表在Nature methods上的:Multiplexed and single celltracing of lipid metabolism,文章的通讯作者是Bonn大学的Christoph Thiele,其主要研究脂质的新陈代谢,脂质间及其与蛋白质的相互作用,并开发了一系列相应的工具来进行研究。
这篇文章主要开发了一个利用点击化学和质谱技术联用的手段,实现了脂质类化合物的时间尺度的示踪,并且成功把这项技术应用于单细胞系统中。
代谢追踪是了解健康和疾病中代谢途径复杂性的关键技术。而脂肪酸约占正常营养中的三分之一,但我们对其代谢动力学的了解十分有限。对于脂肪酸示踪,之前的同位素示踪方法分析较为复杂,面对质谱中数百种脂质,数据分析相对困难。作者之前开发了基于引入了炔烃标记的脂肪酸,进行点击化学和荧光检测的系统。但是由于其检测限过高,且用薄层层析方法无法分离脂类化合物,因此作者开发了一个利用点击化学和质谱技术联用的,时间尺度的示踪脂质类化合物的方法。
这个方法和TMT标记的思路类似,首先作者合成了一个标记分子:C171,这个分子是由一个带电荷的报告基团,一个连接基和一个叠氮基团组成,叠氮集团可以和外源引入的脂质末端炔基发生click反应,而反应物在二级质谱的中等能量下,会进行自我碎裂,碎裂出一个二甲基乙胺基团,从而显示出73.09Da的定量中性损失,而未进行Click反应的C171分子则不会碎裂出二甲基乙胺基团,通过二级质谱的碎裂峰中是否出现73.09 Da的NL,即可判断鉴定出的脂质。之后作者合成了数种脂肪酸,约占正常肝细胞中脂肪酸的96%,将其混合后进行分析测定,发现对于所有含有末端炔基的脂肪酸均可以实现无显著偏好的标记鉴定,且重复性较好,检出限可以降至0.1pM级别。
之后作者设计了多通量的时间尺度示踪脂质类化合物的方法。与TMT多标记方法类似,通过改变连接基团和报告基团的分子量,在总分子量不变的情况下增加报告基团的分子量,从而在二级质谱层面,鉴定不同处理时间下同样脂质分子的数量变化,从而实现时间尺度的脂质分子示踪。考虑到含有炔基的脂质的脉冲效率可能有变化,因此作者在实验室向所有实验组中加入了内标物。首先作者对小鼠肝脏细胞的甘油酯进行了分析,在外加入aPal(16碳炔基酸,16-heptadecynoicacid)或alino(17碳炔基酸 octadeca-9,12-dien-17-ynoic acid)并脉冲标记5分钟后,分别追踪0,5,20,40 min,之后进行click标记,并等量混合后进行质谱分析,即可得到时间尺度的脂类化合物的示踪图,作者从图中发现:标记的二酰基甘油快速代谢产生PC和TAG,而PE和PI的总分数在追逐期间缓慢增加。之后作者对具体的化合物进行分析,发现了一些可能存在的新的脂质通路。
而作者在进行高灵敏度检测点击反应中脂质时发现。将样品以相当于每分钟70个细胞的速度注入光谱仪,会导致许多峰的强度>107。而在检测器中,可以可靠地检测到103的信号强度,这表明每分钟标记的单细胞足以进行定量分析。
为了实现单细胞敏感性,作者将样品量从500 µl减少到20 µl,并根据样品量的减少调整了喷射时间与数据参数。通过有限稀释对细胞取样,总共鉴定出46种标记的PC,TAG等脂质。为了分析单个细胞之间的代谢变化,作者计算了总标记物质的摩尔,并绘制了六个随机挑选的单个样品的光谱图以及所有19个单细胞的平均值。数据证明了该方法的可重复性,但也显示了单个细胞之间的实质性差异。
总之,作者开发了一个利用点击化学和质谱技术联用的手段,实现了脂质类化合物的时间尺度的示踪,并且成功把这项技术应用于单细胞系统中。尽管如此,这个方法无法检测细胞中新合成的脂类,只能检测已有脂类的代谢途径,也无法检测被代谢完全降解的脂肪酸,因此作者希望后续完善这个方法来研究脂质的β-氧化。
本文作者:WXH
联系客服