同源重组与酶切连接

最近总是有人问小编

你们构建载体怎么做的

“我的基因上有很多酶切位点，

没有可选的酶切位点用来构建表达载体呀”

别着急，容小编来一一讲解

传统的载体构建方法——酶切连接法

一、引物设计，引物的长度一般为15-30bp，引物中需要加入酶切位点（如XbaI、EcoRI）及保护性碱基（可增加酶切效率）。

二、 PCR扩增目的基因。

三、用特定的限制性内切酶对目的基因进行酶切（一般酶切效率比较低），同时对目的载体进行酶切。

四、用T4 DNA连接酶进行连接，目的基因与目的载体的摩尔比很重要，而且连接反应体系的体积对效率也有很大关系，之后进行测序鉴定。

专治各种“疑难杂症”——同源重组法构建载体

采用同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体方法不同，该方法不受酶切位点的限制。

一、设计引物时上游引物5’端前面加的是酶切位点（如BamHI）及该酶切位点在载体中对应前面的15个碱基载体片段（上游同源臂），下游引物5’端前面加的是酶切位点（如HindIII）及该酶切位点在载体中对应后面的15个碱基载体片段（下游同源臂）。

二、将载体进行双酶切(或者是单酶切，单酶切假阳性率很高)，使得载体成为两端分别带BamHI、HindIII位点的线性载体；同时PCR扩增目的基因。

三、PCR产物直接用于重组连接，不需要酶切产生粘性末端，而且重组酶的重组能力强于T4 DNA连接酶的连接能力，一般只需要一步即可重组连接成功，因此可以在重组反应之后进行测序鉴定。

总的来说：

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