前沿进展 | 陈玲玲研究组应用CRISPR-Cas13系统于活细胞RNA标记

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11月19日，国际学术期刊Molecular Cell在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)陈玲玲研究组关于CRISPR-Cas13系统应用于RNA活细胞标记的最新研究进展：“Dynamic imaging of RNA in living cells byCRISPR-Cas13 systems”。该研究对多种CRISPR-Cas13蛋白进行酶活突变后，筛选出了具有较好RNA标记能力的dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，使用优化后的CRISPR-Cas13系统可以有效标记非编码RNA和mRNA。进一步联合使用dPspCas13b和dPguCas13b蛋白实现了对活细胞内不同RNA的双色标记，而与标记DNA的CRISPR-Cas9系统联用实现了RNA转录本和基因位点的同时标记。

CRISPR-Cas系统由具有核酸酶活性的效应蛋白(或效应蛋白复合物)与效应蛋白结合的向导RNA (crRNA)组成，在细菌或古细菌体内起着保护宿主抵抗病毒的作用。根据效应蛋白的组成成分和性质分为由多个蛋白成分组成效应蛋白复合物的Class 1和由单一蛋白质发挥效应作用的Class 2两大类。Class 2系统因为组成成分简单而被广泛应用于哺乳动物细胞的基因敲除和敲入以及基因组标记等多种方面，最为人熟知的便是CRISPR/Cas9系统。属于Class 2的CRISPR-Cas13系统，则是向导RNA介导的RNA靶向的内切酶系统。从15年被张峰等人发现至今一共鉴定出四种亚型：VI-A(Cas13a/C2c2)、VI-B(Cas13b)、VI-C(Cas13c)和VI-D(Cas13d)，目前被运用于RNA的敲低、定点编辑、检测以及剪接调控等方面。

在这项研究中，研究人员选取了来源于VI-A(Cas13a/C2c2)、VI-B(Cas13b)和VI-D(Cas13d)三个亚型的8个蛋白并进行了RNA酶活缺失突变，仅使其保留结合RNA的功能。然后在HeLa细胞里对它们的RNA标记能力进行比较，发现无论是对于长非编码RNA NEAT1还是mRNA MUC4来说，来源于VI-B(Cas13b)的dPspCas13b和dPguCas13b都具有较好的标记能力且dPspCas13b的标记能力明显更强，这个标记系统也能适用于HT29和U2OS细胞系。RNA单分子荧光原位杂交(smFISH)和dPspCas13b的双色荧光成像实验进一步证明了dPspCas13b的标记效率，后续实验也主要以dPspCas13b进行。

为了进一步研究gRNA对于CRISPR-dCas13标记系统的重要性，研究人员从gRNA的长度和gRNA与靶向序列的错配位置两方面出发，对标记NEAT1的gRNA进行了一系列改造。首先根据成功标记NEAT1的靶向序列，设计了带有不同长度spacer的gRNA，对比成像结果发现，gRNA的spacer长度在20到27 nt 的长度时dPspCas13b有较好的标记效果，更长的gRNA反而会降低甚至失去标记能力。此外，将gRNA靶向位点前后移动几个碱基，NEAT1的标记信号强弱会出现差异，说明了靶向RNA的结构可能影响标记的能力；进一步通过突变gRNA的spacer上不同位置的碱基，研究人员发现当突变的碱基位于spacer序列的中间区域时，dPspCas13b的标记效果会明显减弱，中间区域两个碱基的突变甚至会使dPspCas13b失去标记效果。此外研究人员还发现gRNA 5’端的碱基突变对标记效果的影响比3’端碱基突变的影响更大。这一系列实验结果对gRNA设计都有很好的指导意义。

进一步，研究人员比较CRISPR-Cas13标记系统和传统常用的MS2-MCP系统发现，MS2-MCP标记系统因为插入多拷贝的MS2重复元件而具有更强信号，但是会影响目的RNA 表达，如MS2-NEAT1使NEAT1的水平下调，而CRISPR-dPspCas13b对目的RNA表达几乎没有影响。通过对NEAT1所组成的paraspeckle进行瞬时动态观察，发现CRISPR-Cas13标记系统和MS2-MCP对paraspeckles的运动能力都不会产生影响。长时间的动态追踪发现了paraspeckles之间可以相互分裂和融合，符合“hit-run/fusion”模型，从而解释了长条形paraspeckle的形成过程。

为进一步实现RNA单分子水平标记，研究人员构建了一系列带有不同拷贝数重复元件的RNA序列(GCN4)。针对重复序列设计gRNA，实验发现当目的序列带有12个及以上重复元件时，通过靶向这些重复元件dPspCas13b可以在单分子水平实现对目的RNA的标记。此外调整dPspCas13b融合的荧光蛋白和核定位信号数目能更进一步地提高CRISPR-dCas13系统对胞浆RNA的标记效果，这暗示CRISPR-Cas13系统具有很大的优化空间。

此外，联合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，研究人员实现了对单一RNA (如SatIII)的双色标记，两个RNA的双色标记(如SatIII和NEAT1),这为研究两个RNA之间的相互关系提供了一个新的工具。此外，联合CRISPR-dCas13系统与CRISPR-dCas9系统，研究人员实现了对mRNA MUC4的基因位点和MUC4 RNA的双色标记以及热刺激或亚砷酸钠应激条件下lncRNA SatIII的基因位点和SatIII RNA的双色标记，并观测到SatIII RNA会大量转录并且聚集在SatIII的DNA附近。这项联用技术为研究RNA的转录调节和RNA与基因位点的关系提供了一个简单和便利的新手段。

生化与细胞所博士生杨良中与博士生王洋为共同第一作者，陈玲玲研究员为通讯作者。该研究受到了中科院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台，GE Healthcare Life Sciences(上海)的大力支持，同时该研究还得到国家自然科学基金委、国家科技部、中国科学院和霍华德·休斯医学研究所项目的经费资助。

图注：CRISRP-dCas13 在活细胞RNA标记上的应用。