【文献解读】文献167：功能性增强子构成染色体外癌基因扩增

Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications

Cell , November 21，2019

背景

• “以基因为中心”的DNA扩增观点侧重于识别拷贝数增加的潜在癌基因，但最近在基因组组成和基因调控方面的研究揭示了相邻区域在转录控制中的重要性。
  

• 由断裂-融合桥或者染色体碎裂产生的癌基因高水平扩增会导致癌基因扩增在均质染色区(HSR)出现或携带在染色体外DNA(ecDNA)上。
  

• 增强子异常活动是导致癌基因表达的驱动因素，从而导致的肿瘤的发生，维持和发展。
  

• 多项研究表明单个增强子的变化可以促进肿瘤的发展。

方法

• 通过CHIP-seq技术检测H3K27ac组蛋白信息，发现增强子与癌基因存在共扩增现象，然后通过ATAC-seq技术确定对应增强子染色质可及，再利用CRISPRi技术设计针对两个增强子区域的靶标，并结合RNA-seq的数据，研究两个增强子对于癌基因表达的影响。通过FISH技术确认ecDNA的存在，利用4C-seq技术研究增强子和癌基因共扩增影响染色质三维拓扑结构，并通过21天CRISPRi扩增脱落筛选，研究ecDNA上增强子重组调控细胞活性。最后对于公共数据库分析，增强子和癌基因共扩增现在存在于多种实体瘤中。

结果

结果-1 胶质母细胞瘤中，EGFR与两个功能性增强子的扩增共选择

• 作者假设任何基因组特征与EGFR基因发生扩增共选择，则相关扩增子将延伸至远端以包含这些特征，表现为扩增子相对于癌基因基因组位置的“倾斜”(Figure1A)。
  

• 对来自TCGA的174个EGFR扩增的胶质母细胞瘤数据进行分析，通过蒙特卡洛方法证明在EGFR上游区域出现扩增倾斜(Figure1B)；利用CHIP-seqH3K27ac标记方法，发现两个增强子与EGFR发生共扩增(Figure 1C)。
  

• 对四株胶质母细胞瘤细胞系(GBM3565, GBM3094, GSC23,G459)进行Chip-seq, ACAC-seq和RNA-seq检测，发现两个增强子均为染色质可及，并且与RNA聚合酶II结合，进而表达(Figure 1D)。
  
• 利用CRISPRi技术诱导胶质母细胞细胞系(G361), 并利用RT-PCR进行表达定量，研究EGFR上游增强子对于EGFR表达和细胞活性的影响(Figure 1E) ，发现定向EGFR任何一个增强子，EGFR表达和细胞活性降低(Figure 1F & Figure 1G)。

结果-2 增强子共扩增在神经胶质起源细胞中活跃

• 作者假设增强子在肿瘤扩增过程中的优先选择取决于它们在肿瘤发生的组织类型中的活性和开放状态，并通过Roadmap Epigenomics Consortium中的134个组织谱进行验证(Figure 2A)。
  
• 在胶质母细胞瘤的EGFR位点上，倾斜区域内的H3K27ac分布与神经系统组织最为相似，特别是海马组织标本和胚胎干细胞衍生的神经球(Figure 2B)。
  
• EGFR上游86kb和130kb的增强子也表现出与SOX2基因结合，而SOX2是一种对神经前体细胞和类干胶质母细胞瘤细胞的维持至关重要的转录因子(Figure 2C)。

结果-3 EGFR和内源性增强子在环形ecDNA保持扩增

• 为了研究EGFR增强子在其扩增环境中的作用，作者鉴定了9种具有EGFR高度扩增的胶质母细胞瘤细胞系(Figure 3A)。
  
• 在两个胶质母细胞瘤中，EGFR上游增强子的拷贝数均高于EGFR基因，说明该增强子受到除EGFR基因外的正向选择(Figure 3B)。
  
• 通过FISH技术发现，在以上2个胶质母细胞瘤中含有ecDNA(Figure 3C)。
  
• 作者通过对H3K27ac CHIP-seq数据分析，重建了4个胶质母细胞瘤ecDNA结构(Figure 3D)。
  
• 在重构的ecDNA结构中除了包含上游增强子外，还包含相邻基因或者活跃的调控元件的重排，其中GBM35653跨越2个TADs的3个非连续的片段通过ecDNA连接在一起(Figure 3E)。

结果-4 ecDNA EGFR扩增影响染色质三维拓扑结构

• 通过分析未扩增胶质母细胞瘤模型的TCTF CHIP-seq数据，并整合公共数据库中HIC数据，作者研究了其三维拓扑结构(Figure 4A)。
  
• 利用4C-seq分析EGFR未扩增样本GSC23, 发现EGFR与两个上游增强子以及基因体内的多个增强子有很强的联系(Figure 4B)。
  
• EGFR扩增样本GBM3565的4C-seq结果显示，其拓扑结构存在大量的重排(Figure 4C)。
  

结果-5 ecDNA上增强子重组调控细胞生存能力

• 作者利用21天CRISPRi-dropout筛选技术研究。
  

• EGFR扩增样本(GBM3565)和EGFR未扩增样本(GSC23)每一个调控元件的作用，该编辑技术设计了针对超过100个区域的9,559个导向(Figure 5A)。
  
• sgRNA锚定在EGFR启动子区域内，细胞显著减少，表明EGFR启动子对细胞的适应性有很强的促进作用(Figure 5B-D)。

结果-6 增强子共扩增存在于多种实体瘤

• 为了鉴定增强子共扩增是癌症中普遍现象，作者选择来自公共数据库中的9个代表性癌种SNP芯片数据进行分析(Figure A)；在743个肿瘤样本种筛选扩增癌基因，并且与COSMIC癌基因取交集得到43个基因，通过H3K27ac CHIP-seq数据分析与癌基因发生共扩增的增强子(Figure B), 其中30个癌基因含有与之共扩增的增强子，揭示了癌症共扩增的一般模式(Figure C)。
  

• 通过蒙特卡洛方法发现15种扩增倾斜，其中7种倾斜区域包含癌基因附近的癌基因，7种倾斜包含非编码区域或者致癌功能的基因(Figure D)。
  
• MYCN在神经母细胞瘤和肾母细胞瘤种的倾斜模式不同, 其中神经母细胞瘤呈现一种3’超增强子的倾斜，而肾母细胞瘤呈现5’超增强子的周期性倾斜(Figure E & F)。
  
• 在神经母细胞瘤中，共扩增的超增强子在胎儿肾上腺组织中最为活跃，其富含神经嵴衍生物，被普遍认为是神经母细胞瘤的细胞类型来源（Figure G). MYCN驱动的神经母细胞瘤，神经鞘决定了MYCN, TWIST1和 GATA3(Figure H). 肾母细胞瘤中MYCN超增强子对人胚胎肾的特异性最强(Figure I).在胚胎肾脏中，对肾脏发育至关重要的间充质转录因子SIX1和SIX2占据了这些增强子(Figure J)。

结论

• 作者发现包含增强子的临近非编码区域与癌基因共扩增，并且与线性染色体存在联系。
  

• 扩增环化能够形成新的调控元件并影响到癌基因的拓扑，并且这种调控重新连接有助于癌基因对癌症适应度的影响。

讨论

• 作者发现一种新的致癌基因重写调控机制，即癌基因和增强子共扩增，然后环化，其整个位点都是驱动因子，包含致癌基因、增强子、它们的拓扑接触，以及可能的其他未知调节特征，即“ON-CO位点”。
  

• 此发现可能针对目前无靶药的癌基因提供干扰途径。