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IHC/ICC是相对简单和直接的实验方法。然而,每个IHC/ICC实验都有多个需要优化的变量。最主要的挑战是针对不同抗原,如何优化实验条件,以产生特异性高且信号强的实验结果。本篇微信列出了影响IHC/ICC的变量和因素,旨在有助于IHC/ICC实验的设计、优化及疑难的解答。
组织和细胞样品必须经正确地收集和处理之后才能用于IHC/ICC研究。在多数情况下,通过单个实验变量可以确定最合适的样品准备法。想知道你的样本适用于何种收集和处理方法就来看看这篇吧~
IHC和ICC实验中所有样品都必须固定,以保护组织形态和目标分子的抗原性。固定会改变组织的化学组成,在保护组织结构和维持抗原表位之间常常需要进行权衡。细胞或组织固定不充分给蛋白在组织内快速降解留下了机会,会影响特异性的免疫反应。然而,过度固定会遮蔽抗原表位或导致很强的非特异性的背景染色,掩盖特异性染色。都有哪些因素会影响固定的程度呢?答案都在这里...
用合适的方法准备和固定组织和细胞样品之后,就可以进行染色了。如何避免非特异性染色?相信这个问题一定让不少人困惑头疼吧,那就来看看这篇微信吧!
实验的每一小步,都是决定结果的一大步。在设计IHC/ICC实验时,一抗的选择是最重要的因素,而一抗的关键特征是抗原表位的特异性。本期为大家讲解的是IHC/ICC实验中一抗的选择和优化!
与一抗孵育之后,可利用适当的检测系统来观察抗体结合。检测方法可以是直接的,也可以是间接的,产生荧光或显色信号。本期为大家讲解IHC/ICC实验中检测和显像的方法。
适当的对照对于IHC/ICC结果的准确阐释至关重要。令人满意的IHC/ICC实验设计产生的结果能够证明抗原位于正确的组织、细胞类型或亚细胞定位。固定、封闭、抗体孵育和抗原修复步骤的优化将产生强烈而特异的信号。因此,IHC/ICC实验必须包含阳性和阴性对照,以支持染色的有效性,并识别实验假象。本篇微信中,我们介绍了一些公认的对照,可用来证实您IHC/ICC结果的特异性。
尽管固定对于组织形态的保留是必不可少的,但这一过程对IHC/ICC检测也有不良影响。固定可能改变蛋白的生化特性,如目的表位被掩盖不再与一抗结合。表位的掩盖可能是由表位内氨基酸的交联、表位或附近位点与无关肽段的交联、表位构象的改变或抗原静电荷的改变引起的。抗原修复则是任何可以逆转表位掩盖和恢复表位-抗体结合的技术。
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