微生物支持植物健康：微生物菌剂在复杂条件下如何成功发挥作用？

    利用有益微生物是提高植物健康和生产力的一种有前途的可持续方法。有益微生物是天然的土壤居民，已被证明对植物性能和健康有益。当应用于农业以提高作物产量和性能时，这些微生物通常被称为生物接种剂。然而，尽管生物接种剂具有良好的特性，但其功效在现场可能会发生巨大变化，妨碍其应用。根际微生物组的入侵是生物接种成功的关键决定因素。入侵是一种复杂的现象，是由与当地、常驻微生物组和宿主植物的相互作用形成的。在这里，我们通过交叉生态学理论和微生物入侵根际的分子生物学来探索所有这些维度。我们参考了中国著名哲学家和战略家孙子的思想，他认为解决问题需要深入了解问题本身，以回顾决定生物接种剂有效性的主要生物因素。 

引言：在你采取行动之前要仔细思考

过去和现在的人为干扰正在降低世界各地的土壤质量，并因对粮食生产的强烈需求而降低了作物产量。与此同时，正在共同努力开发可持续的农业技术，这些技术可以在减少合成化学品投入的同时保持或提高生产力。增强植物健康最有前途的方法之一是利用形成植物微生物组的大量微生物的优势。植物适应性的许多关键特征取决于集合的微生物组，如营养均衡、对干旱和盐胁迫的恢复力或对植物病原体的自然保护。有益微生物支持植物健康的例子科学研究很多。生物接种剂由应用于土壤的单个或多个微生物物种组成，是植物微生物群工程最常见的形式。

与生物接种剂相关的益处通常是通过其在宿主植物根部的定殖提供的，常见的是根际环境中的生物接种剂密度极大地决定了最终的功效。生物接种剂是否能成功植入，即成功入侵的微生物，取决于局部适应的常驻微生物群、土壤因子、宿主基因型、根系结构和组织特异性表达，入侵者密度和入侵事件的时间，以及生物接种物绕过这些屏障并在微生物组中建立自身的固有能力。所有这些通常使生物接种剂的设计强烈依赖于试错分析，最终实验室中最有前途的生物接种剂在实践农业条件下表现出功效。 

图1。影响生物接种物植入根际微生物组的过程和机制。（a）生物接种剂的活性取决于其生理状态以及与其他微生物的相互作用。（b）与居住微生物组的积极相互作用可以用来促进接种微生物的入侵。（c）无论入侵成功与否，入侵者都会对驻留的微生物组产生影响，从而对植物健康产生积极影响。（d）植物宿主可以通过其免疫系统和分泌不同的代谢产物来控制其微生物组。生物接种物与宿主沟通或适应宿主的方式对预测其在入侵期间的成功至关重要。 

了解你自己，了解你的敌人：生物接种剂的生理学和局部相互作用决定了应用效果

微生物特征，如生长速度、碳利用率、抗生素化合物的产生或形成生物膜的能力，被认为与生物接种剂的成功有关。然而，这些特征的表达取决于微生物的生理状态。就假单胞菌属而言，这是一个差异很大的分支，包括许多潜在的生物接种物，大多数与其有益活性相关的次级代谢产物都是在生物膜状态下产生的。同时，这些代谢产物的产生可能会被周围的其他微生物显著改变，从而影响生物接种剂的效力。例如，抗菌药物绿脓杆菌素和2,4-二乙酰基氯葡糖醇（DAPG）的产生对防御假单胞菌（Pseudomonas protegens）的生物控制活性至关重要，并且在感测到相关假单胞菌分泌的代谢产物后，绿脓杆菌蛋白的产生可以增强。反过来，绿脓杆菌素对这种相关的假单胞菌的抗菌作用会导致细胞内化合物的释放，这些化合物会抑制假单胞菌中DAPG的产生。在贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）中，感应假单胞菌的铁载体可以增强次级代谢产物的产生，增加其存活率，并引发广泛的抗菌活性。微生物-微生物的相互作用经常增强不同环境中抗菌化合物的产生，包括植物叶层。相反，同一项研究表明，从土壤中分离出来的菌株产生了组成型抗菌剂，这可能是适应微生物密度高得多的环境的结果。然而，在之前的一项研究中，42%的土壤分离株只有在与其他特定分离株相互作用时才会表现出抗菌活性。这些发现与研究一致，研究表明，大多数微生物生物合成基因簇（BGC）在外部刺激（通常是抗菌化合物）诱导其表达之前保持沉默。

一般来说，密切相关的生物体之间的直接竞争更为频繁，通常会导致菌株排斥。例如，共生假单胞菌能够通过迄今未知的机制保护宿主植物免受密切相关的假单胞菌病原体的侵害，并且密切相关的菌株可以通过释放泰洛菌素（杀菌蛋白复合物）相互抑制。相比之下，密切相关的枯草芽孢杆菌菌株基本上可以合并菌群并共同定殖表面，而亲属歧视导致将远距离菌株从菌群中排除，这也是在生物膜发育过程中观察到的现象。

相反，一些微生物以完全独立的方式移植，几乎无论居民社区是什么样子。由于这些生物对当地条件的依赖性降低，因此有可能在农业中更广泛地应用。只有少数例子描述了这种潜在的优越生物接种剂，其中之一是恶臭假单胞菌菌株（P.putida）。该菌株能够积极入侵生物膜，这要归功于水平获得的IVB型分泌系统，该系统具有广泛的接触依赖性毒性，确保了P.putida能够移植到根际群落中，并具有强大的生物控制活性。 

明智的战士避免战斗：与居住微生物的积极互动促进植入

生物接种物和其他微生物之间的相互作用不一定是竞争性的，相反，它们也可以是促进性的。宿主微生物组的特定成员可以通过直接和间接机制帮助生物接种物入侵。此外，有很多例子表明，与某些“辅助”菌株共同接种的生物接种物能够更好地在新环境中建立并持续存在，从而提高植物性能。在杆菌中，植物的生长促进作用取决于根际生物膜的形成，而这一过程受到与其他微生物相互作用的影响。例如，与自身不一定具有根际能力的辅助菌株共同接种增加了枯草芽孢杆菌对拟南芥根的粘附。在黄瓜根际，双菌种接种B.velezensis和Pseudomonas stutzeri比单菌种更有效地促进了植物生长，并且与单一接种相比，两种接种剂在共同接种时都达到了更高的丰度。有趣的是，这种协同作用只有在营养丰富的静态条件下才明显，这意味着空间结构和营养有效性是其协同性质的关键。一般来说，与单菌株接种相比，菌群通常对驻留的微生物群落有更大的影响，因此可能更好地刺激植物生长，并保护植物免受不同的胁迫。

了解病原体入侵的机制有助于阐明生物接种剂的成功或失败，因为类似的生态学原理也适用。许多微生物可能是根际病原体的助手。尽管病原体入侵背后的分子机制仍不明确，但铁载体的兼容性和对土著菌群产生的抗菌药物的耐受性似乎发挥了重要作用。由于病原体抑制作用的丧失，促进性相互作用促进病原体青枯菌在体外和体内的入侵。实验验证的成对相互作用的数学模型预测，抑制病原体辅助菌株比直接靶向更能降低根际的病原体密度。一般来说，越来越多的证据证实，共存物种之间的相互作用，而不是特定物种及其功能特征的存在或不存在，是疾病抑制的最重要决定因素。

群落成员和入侵者之间的相互作用可以从对抗性转变为促进性，反之亦然，当允许共同进化时。最近有报道称，居民社区的促进作用使入侵者能够在有毒介质中生存和生长，如果没有这些促进作用，入侵者将无法生存。然而，群落在共同进化后变得对入侵具有抵抗力，这可能是由于群落成员的生长增加抑制了入侵者的生存。在两种著名的植物有益微生物中也观察到了从拮抗到共存的转变：绿叶假单胞菌Pseudomonas chlororaphis 和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。具有抗菌活性的次级代谢产物的产生赋予了相互拮抗作用。然而，共同进化推动了这两个物种中自发突变体的出现，这些突变体通过修饰各自的靶标来抵抗竞争分子。尽管这些突变是以多效性效应为代价的，但它们促进了两种生物之间的共存，这显然超过了这些效应。这两项研究共同为设计未来的生物接种剂时需要考虑的简单和更复杂的微生物相互作用的适应性机制提供了有价值的见解。 

所有的战争都是基于欺骗：利用入侵对原驻菌落的影响

生物接种剂的入侵具有改变微生物群落的能力，并且这些改变可能被用来影响植物健康，而不管生物接种剂结果如何。这种影响的大小取决于生物接种物的生态位，特别是资源使用和常驻分类群之间的重叠。这种重叠的存在可能会影响社区内的竞争活动，从而改变其组成。例如，芽孢杆菌的短暂入侵会导致土壤中细菌多样性的变化，这种变化会持续很长一段时间，而与入侵者的持续性无关。在群落组装的早期阶段，入侵主要影响富营养型微生物（在营养丰富的环境中发现的快速生长的生物），而富营养型可能与入侵者共享一个生态位，因此，在营养稀少的环境中找到的生长缓慢的生物——寡营养型似乎在群落组装后期受益。用大肠杆菌在土壤中也引起了类似的影响，这种影响在其消失后仍然存在。值得注意的是，入侵后群落组成的变化与群落资源的使用相关。将枯草芽孢杆菌引入土壤衍生的合成群落后，群落组成发生了类似的变化。因此，菌群中亲缘关系相近的菌株受到了抑制。这些例子证实了生物接种物可以以一种依赖于生物接种物和群落功能的方式影响微生物组的观点，但问题仍然存在，这种影响是否会导致另一种稳定状态，或者群落是否会转变回其初始状态，并对植物健康产生相应的后果。由关键微生物物种或功能的丰度和/或存在的变化支持的替代状态，可能是观察到的植物健康变化和对选定病原体入侵的抵抗力的原因。然而，入侵的遗留问题可能会促进未来的入侵尝试和反复接种，并可能是生物接种剂应用成功的决定因素之一。因此，我们得出的结论是，重要的是要跟踪生物接种剂在长时间内的应用效果及其可能引发的替代状态，以了解入侵是否会导致微生物群落的长期功能变化。

通过添加生物接种剂，可以利用对常驻菌群的间接影响，挖掘在当前条件下土壤和/或根际罕见的植物有益微生物的“新”资源，这些生物接种剂不一定需要直接对植物有益。在番茄根际引入有益于植物的假单胞菌菌株群落增加了居民群落中稀有类群的频率，可能是通过与更丰富的类群直接竞争资源。值得注意的是，群落组成的变化最好地解释了观察到的对植物生长的有益影响，而不是入侵者群落特定的有益特征，但这些变化如何导致植物生长的改善仍有待回答。接种物种类越多，效果越大，表明某些菌株之间存在协同作用。同样，将有益微生物解淀粉芽孢杆菌引入番茄根际，导致对青枯菌的抑制作用增强，无论接种物的丰度如何，这可能是由于入侵群落中携带抗菌BGCs的微生物富集。

除了对常驻微生物群落的入侵诱导作用外，生物接种物还可以永久改变宿主的生理机能，即使在生物接种物从群落中清除后也是如此。例如，生物接种物诱导的商陆根中差异DNA甲基化导致生长促进，而接种物诱导根际微生物组的功能水平变化仅在微生物群落组装的早期阶段检测到。

 了解战场确保胜利：入侵取决于与宿主的互动

生物接种物最终需要与宿主植物相互作用，这就产生了决定微生物组合的基因型依赖性选择。宿主驱动的选择最终使其与微生物组的兼容性和合作性得以出现，这转化为微生物宿主偏好。因此，在设计未来有效的生物接种剂时，与宿主植物的兼容性和相互作用具有高度相关性。

进化研究展示了如何优化生物接种物与目标宿主的兼容性的例子。在与拟南芥单结合的假单胞菌和杆菌中，合作和互惠的微生物特征迅速出现。进化的分离株显示出根系定殖能力的提高，部分原因是细菌行为的主要调节因子突变，如诱导主要生理变化的GacA/S双组分系统。此外，假单胞菌的另一个主调节系统，即ColR/S双组分系统，在菌株水平上与宿主适应有关，同时也是抵御其他致病性假单胞菌所必需的。这种宿主驱动的进化表明，主调控系统是优化生物接种物兼容性的关键目标，应在未来加以利用。

相容性的一个重要决定因素是与宿主免疫系统的相互作用。在一些有益微生物中，如B.velezensis，需要宿主来源的活性氧（ROS）来刺激细菌分泌生长素，从而诱导侧根形成并抵御真菌病原体。相反，众所周知，ROS的产生会广泛限制根际定殖，因此，许多成功的根定殖生物，特别是放线菌和γ-变形菌，已经制定了通过局部或系统抑制免疫反应来规避这一点的策略。

除了宿主免疫活性外，根系分泌物的利用是微生物相容性的主要驱动因素。例如，从拟南芥和番茄根中渗出的肌醇增强了Priestia megaterium（前：巨大芽孢杆菌）在其各自根上的趋化性和生物膜产生，从而促进生长。在枯草芽孢杆菌和假单胞菌中，蔗糖渗出增强了定植作用，从而增强了对植物病原菌镰刀菌和灰葡萄孢的抗性。

此外，整个根系的免疫活性和渗出情况并不均匀。不同的渗出代谢产物聚集在根部的不同区域，免疫反应的强度和范围是细胞层和细胞类型特异性的，并依赖于局部损伤。此外，厚壁菌门和变形杆菌分离株在不同形态的叶片中定植的实验表明，定殖表面的空间组织在决定接种物的成功方面发挥着关键作用。这三个因素的结合在根部产生了特定的微生境，生物接种物最终将在那里与宿主相互作用。例如，表皮成毛细胞通过香豆素的分泌介导与假单胞菌WCS417的有益相互作用，许多生物优先在根尖和伸长区定植。

这些研究强调了生物接种物-宿主相容性的重要性，但也强调了精确入侵的微生境对预测相容性和最终生物接种物植入的局部决定因素的相关性。

 在混乱中，也有机会：走向未来的生物接种剂

在前面的章节中，我们讨论了生物接种物植入和成功背后的变异性的相关来源。这个话题的现状可能会被《孙子》定义为：“一个人可能知道如何征服，但却无法征服”。然而，尽管我们在技术上能够在土壤中应用生物接种剂，但克服微生物入侵的复杂性需要更多关于土壤中有益微生物的生理学和控制微生物组的局部相互作用的知识。例如，微生物的生物合成能力在很大程度上仍未得到充分开发，已知代谢物在微生物生理学中的作用仍在被发现，即使在经过充分研究的微生物中也是如此。例如，土壤中的运动性是土壤生物接种剂的另一个关键特征，目前才被表征。在枯草芽孢杆菌中，Engelhardt和合著者最近描述了土壤中趋化运动的一种集体形式。当枯草芽孢杆菌细胞群落感觉到附近有根存在时，细胞会像羊群一样在土壤颗粒中移动，并在根尖周围动态排列。这一发现表明，我们需要专门的实验来了解当前和未来生物接种物中的这些机制，以及它们与成功定殖的相关性。

从生物接种物和常驻微生物中了解遗传和生理特征，可以预测基因组规模的相互作用，反过来，从长远来看，也可以进行群落工程。最近的进展，包括单细胞测序技术，如Microbe-seq和Live-seq，可以提供有关根际微生物生理学的更详细信息，特别是随着测序和序列分析软件的改进，可以更好地从复杂的宏基因组中重建基因组，并更彻底地从现有宏基因组中检索信息。与宿主和其他微生物的相互作用可以受益于空间元转录组学的新技术，以及单细胞分辨率下微生物转录活性的分离，以及与扩增显微镜和测序的新组合。其他研究选择通过大胆的创新来克服疗效的可变性，例如使用封装的微生物，从而实现合作相互作用的工程。

然而，有时，即使是“失败的”生物接种剂也可能产生有益的效果，并且在许多实验中根本看不到。一种能够在体外促进拟南芥生长的植物生长促进芽孢杆菌分离物对人工土壤中的地上部生物量没有任何影响，但其应用增加了角果的总数。这表明，在评估生物接种剂效果时，应在实验条件下考虑基于生产力的参数。

对孙子来说，深刻了解自己和对手就等于避免了战争。通常，理解和应用微生物作为生物接种剂的努力来自明显相反的角度，从在难以概括的特定环境中研究特定基因，到难以解释特定情况的大规模生态动力学和概念。然而，相对较少的研究在试图将入侵理解为一种生态和机械的复杂现象的同时，将这两个世界结合起来。确保生物接种剂直接或间接地对植物适应性有益，需要与生态学原理和依赖于并产生这些原理的分子机制相协调。从这个意义上说，未来的工作应该集中在确定生物接种剂可以提供最大益处的精确微栖息地，并研究其入侵如何在其中的条件下取决于其自身的生理学，以及与原驻群落和宿主的相互作用如何决定其移植及其在野外的影响Cur Opin Mic 2023 73