CK注：原文发于CK医学2021-02-16
CK注：1921年7月，Banting和Best制成了第1份呈粉红色的“高纯度”胰腺提取液；1923年，年仅32岁的Banting获得诺贝尔奖。
胰岛素100年
简史专业版
陈康 编译
究竟谁最先发现胰岛素一直存在很大争议。100年前，许多科学家在确定胰腺内分泌作用和胰腺提取物降糖潜力方面做出了重要的和开创性的贡献。
关于多伦多四人组和胰岛素发现的历史故事可见：
关于他们的电影有一部，叫Glory of enough for all；
1921年5月17日，当时弗雷德里克·班廷（Frederick Banting）和查尔斯·贝斯特（Charles Best）在位于加拿大多伦多约翰·詹姆斯·里卡德·麦克劳德（ John James Rickard Macleod）的实验室开始这一令后世瞩目的夏季研究项目，而至今，这一里程碑式的成就已经100周年（J Lab Clin Med87(20):1046–1051）。此研究项目首次证明，制备的一种胰腺提取物，可以持续降低血糖，逆转酮症，并成功抑制1型糖尿病的分解代谢作用。随之而来的是胰岛素的快速商业化和大规模应用于临床。
在获得胰岛素之前，1型糖尿病的治疗主要包括严格的能量限制。这种负能量平衡，加上β细胞自身免疫破坏所致内源性胰岛素分泌快速下降，会导致短期内持续体重减轻、消瘦，最终引起糖尿病酮症酸中毒、昏迷和死亡。1922年以前，儿童糖尿病是普遍致命的。相比之下，在那个时代，应用胰岛素的第一批50名患者治疗的临床结果更凸显其戏剧性的拯救生命的重大价值。正如1923年发表于BMJ的相关报告所指出 [Br Med J 1(3236):8–12，1923]:
... 目前为止，已有50多例糖尿病患者接受了胰岛素治疗。... 许多病人是在极度营养不良的情况下来到医院的，他们身体非常虚弱，不喜欢任何身体活动。在治疗的第一天或第二天，如果给予足够的胰岛素，尿糖可转为阴性，在第二天或第三天尿酮转为阴性。…病人在（治疗）第一周结束前意识到力量在增加。… 饥饿被食欲取代；口渴减轻，水肿消失，这在这些病例中很常见。病人发现他们不那么易激惹，并表示睡眠很好。表达改善；皮肤变得不那么粗糙和干燥；甚至头发变得更柔软；事实上，糖尿病人特有外貌消失。十天之后，身体恢复相当大的活力。一些病人经过一个月的治疗后已经能够重返工作岗位。
弗雷德里克·班廷，瓦尔特·坎贝尔，阿尔蒙·弗莱彻
Up to the present time over fifty cases of diabetesmellitus have been treated with insulin. ... Many of the patients have come tothe hospital in the state of extreme under-nutrition, suffering from great weaknessalong with an indisposition to any physical activity. On the first or secondday of treatment, if sufficient insulin is given, the urine becomes sugar-free,and on the second or third day ketone-free. These patients become conscious ofincreasing strength before the end of the first week. … Hunger is replaced byappetite; the thirst is lessened, oedema, which is common in these cases,disappears. Patients find they are less irritable and state that they begin tosleep well. The expression improves; the skin becomes less harsh and dry; eventhe hair becomes softer; in fact, the patient loses that appearance whichcharacterizes the diabetic. In ten days a very considerable amount of physicalvigour is restored. Some patients have been able to return to work after amonth of treatment.
Frederick Banting,Walter Campbell, Almon Fletcher
尽管已经发现胰岛素的这种显著的治疗反应，到发现者清楚的知道早期使用胰岛素治疗仅仅只是是开始，麦克劳德（Macleod）和坎贝尔（Campbell）在1925年指出，在使用胰岛素时，如果能够提供胰岛素以模拟自然过程，是最理想的。而接下来的数十年(1930-1970)，越来越多的研究揭示了1型糖尿病常规胰岛素治疗相关不能解决的毁灭性微血管和大血管并发症。其中包括视力障碍风险增加31%，中风风险增加10%，截肢风险增加12%，心肌梗死风险增加21%，肾衰竭风险增加22% [Diabetologia 14: 363–370，1978]。
在过去的100年中，胰岛素治疗取得长足进步。1993年，具有里程碑意义的DCCT试验表明，采用适当的强化糖尿病治疗方案(胰岛素泵或每日多次注射)，可以在没有现有并发症的个体中预防糖尿病并发症(一级预防队列)，或者在有早期并发症的个体中减缓进展(二级干预队列)[ Diabetes Care 39 (8): 1378–1383，2016]。这项里程碑式的研究最终确立“葡萄糖假说”（glucose hypothesis）的有效性:即高血糖是糖尿病微血管并发症的主要原因。近年，DCCT的长期流行病学随访研究，糖尿病干预和并发症流行病学(theEpidemiology of Diabetes Interventions and Complications，EDIC)研究表明，随着血糖控制的改善，1型糖尿病患者能够达到基本正常的预期寿命[N Engl J Med 329 (14): 977–986; 1993; Diabetes Care 39(8): 1378–1383，2016]。胰岛素发现及其随后作为糖尿病治疗发展的100周年，提供了一个机会可以反思胰岛素发现历史，而这个历史应从19世纪开始。
近现代糖尿病的早期关键研究
1869年，德国医科学生保罗·朗格汉斯（Paul Langerhans）在整个胰腺中发现不规则形状细胞岛。虽然当时没有意识到这些细胞岛（“胰岛”）的重要用途，但随后被鉴定为负责产生胰岛素、胰高血糖素和其他肽激素的细胞。而后来被称为“胰岛素”的最早记载可以追溯到1889年，当时德国的研究人员正在研究胰腺对消化的影响[Arch Exp Pathol Pharmakol，26:371–387]。在对一只狗进行全胰腺切除术后，研究人员注意到可以发现苍蝇和其他昆虫会萦绕在狗尿液周围，并以之为食。这是胰腺在葡萄糖代谢中起重要作用的早期线索。随后的十余年中,M. Eugène Gley通过实验证明，胰腺提取物能够减少去胰腺狗的糖尿（1891-1905）[C R Seances Soc Biol 3: 225–228, 1891; C R Seances Soc Biol 4: 841–846, 1892 ; C R Seances Soc Biol 2: 1322, 1905]。而Georg L. Zülzer的工作通过对狗和糖尿病患者胃肠外施用胰腺提取物证实这一观察（1908年）[J Exp Pathol 5: 307–318]。他随后获得了胰腺提取物专利，但这种提取物没有被广泛使用。
20世纪伊始，美国病理学家尤金·奥皮(Eugene Opie)发现胰岛产生后来被证实为胰岛素的物质（1901）[ J Exp Med 5 (4) : 397–428]。他证明了胰岛的破坏会导致糖尿病。“胰岛素”一词似乎是由比利时生物化学家 Jan de Meyer于1909年首次提出的，但有争议。该术语来自拉丁语词根islia，意为“岛屿island”。
到1916年，罗马尼亚生理学家尼古拉·保罗斯库（Nicolae Paulescu）开发了一种胰腺提取物，能够降低糖尿病狗的血糖水平。然而，其在此领域的工作因第一次世界大战而停滞不前，直到1921年才发表（Arch Int Physiol16:85–103）。值得注意的是，虽然保莱斯库等已经证明胰腺提取物可以减少糖尿，但这种减少并不总是持续的，通常与危及生命的反应有关，并且没有在人类中进行结论性研究。
在班廷（Banting）、贝斯特（Best）和麦克劳德（ Macleod）的卓越工作之前的1919年，还有一个关键的发现[J Biol Chem 40: 153]。在纽约市洛克菲勒研究所（ RockefellerInstitute）工作的伊斯雷尔·克莱纳（IsraelKleiner）能够反复验证使用胰脏水溶液会导致低血糖。而既往实验证明的是糖尿减少而没有检测血糖是否减少，原因是血糖检测方法在1919年之前还没有很好地建立。无论如何，Kleiner所提取的的胰腺提取物并非可用于糖尿病患者的纯度。在Kleiner和此前许多科学家工作，为班廷及其团队“发现”胰岛素奠定基础。
胰岛素发现:故事是如何开始的
Banting（班廷）出生于安大略省伦敦市，在多伦多大学完成医学院训练后，原本打算成为一名外科医生；然而，其外科实习申请没有成功，便回到安大略省伦敦，在那里他开了一家全科诊所。除了行医之外，他还在伦敦西部大学解剖实验室任教。在准备一个关于碳水化合物代谢的讲座时，他回顾当时发表的一篇论文，题为“Langerhans岛与胰腺结石病例的关系”[Surg Gynecol Obstet 31: 437–448；1920]。正如Banting临床日记所记录的那样，在演讲前夜，他从睡梦中醒来，注意到以下几点:“糖尿病[原文Diabetus]结扎狗的胰管。让狗活着直到腺泡退化离开胰岛。尝试分离这些的内分泌来缓解糖尿（Diabetus Ligate pancreatic ducts of dog. Keep dogs alive till acinidegenerate leaving islets. Try to isolate the internal secretion of these torelieve glycosurea）（J Hist Med Allied Sci 48 (3): 253–274；1993）。
虽然Banting没有接受过正式的研究训练，但他对提取胰岛素的想法很感兴趣，但困难是由于胰岛暴露于胰腺的其他成分时遭到破坏，于是他回到了多伦多大学。在那里，他找到生理学教授麦克劳德（Macleod），指导他提出项目作为夏季研究内容。麦克劳德（Macleod）同意了，虽然这项工作没有报酬，但他确实为Banting提供了实验室空间设备、研究动物（狗）和一名学生助理。查尔斯·贝斯特（Best）作为学生热衷并积极参与这个项目，因为他最喜欢一位亲戚（舅母）当时刚死于糖尿病。掷硬币获胜后，贝斯特（Best）被分配为学生助理的角色。
Banting和Best首先试图通过胰管结扎切断连接胰腺和小肠的导管来分离胰岛素[Diabetes Care 16 (Supplement 3): 4–7；1993]。导管结扎使产生消化酶的胰腺腺泡外分泌细胞萎缩，从而留下胰岛。与接受胰腺切除术的狗相比，如此结扎管道的狗没有患糖尿病。这项观察进一步支持Banting关于保留胰岛以分离胰岛素的重要最初假设，但一个关键困难是在胰管结扎后让狗存活足够长的时间。
直至1921年7月，他们的夏季研究项目已进行两个月，Banting和Best已经成功分离出溶解在生理盐水中的（外分泌细胞）萎缩胰腺溶液。然后，他们将这种溶液注射到一只切除了胰腺的狗体内（切除已先后为糖尿病）。令人惊讶的是，这一方法能够用胰腺提取物让狗活下来。该结果令人鼓舞，但接下来的问题是继续生产稳定和足够数量的胰腺提取物。在麦克劳德（Macleod）指导下，到1921年下半年，他们邀请科利普（Collip）加入团队。
克里普（Collip）是一名熟练的生物化学家，毕业于多伦多大学，正在加拿大阿尔伯塔大学休假。他的主要贡献是帮助该团队纯化出安全稳定的胰岛素提取物，而这一点在几乎所有以前的团队都失败了。提取方法包括结合不同浓度的微酸性酒精和低温来灭活胰酶，这需要中性的酸碱度和体温来活化，因此，在胰岛素被胰酶消化之前提取胰岛素，并且没有毒性污染物。团队Collip的加持，终于能够生产出足够纯度和效力的胰腺提取物供人类使用。
首次成功使用胰岛素治疗患者
1922年1月11日，一种被称为“麦克劳德血清（'Macleod serum）”的胰岛素提取物被用于一个名叫伦纳德·汤普森（ LeonardThompson）的14岁男孩(每侧臀部7.5ml)。虽然这种胰腺提取物能减少患者糖尿，但效果有限。在对胰腺溶液进行进一步改进(主要是Collip的努力)后，从1922年1月23日开始的第二系列注射使患者糖尿快速减少和（尿）酮症缓解。这标志着第一次在1型糖尿病患者使用胰岛素获得成功，并最终导致快速市场化胰岛素的研发和大规模应用于临床。同时，患者伦纳德·汤普森的图表还记录了皮下胰岛素的第一次不良反应，以及注射部位反应发生(图1). 值得注意的是，这是对最初胰腺提取物的反应，而不是Collip后续开发的制剂。
图1 记录来自1922年1月胰岛素给药
伦纳德·汤普森（Leonard Thompson）成功注射胰岛素后，多伦多总医院成立了一个临床小组来监督其他患者的胰岛素注射[ J Obes Metab Res 2:605–635；1922]。正如Campbell等所描述的那样，这些患者中的许多人因糖尿病已经处于昏迷状态，因此，胰岛素给药对这些患者来说确实是救命的。
胰岛素的广泛生产
虽然胰岛素的成功应用是一项巨大成就，但在随后的几个月里问题开始出现。其中之一，Banting小组没有记录纯化方法的精确步骤，到1922年3月，小组无法再生产胰岛素[ https://insulin.library.utoronto.ca/about/collip]。这是在之前的两个月内接受胰岛素治疗的患者直接关心的问题，并对大规模生产的可能性产生极大疑虑。
到1922年春天，多伦多团队再次成功生产胰岛素，但也意识到自身没有能力进行大规模生产。因此，他们与礼来公司（Eli Lilly）George H. A. Clowes合伙。Collip 和Banting分享了其“胰岛素配方”，几周之内， Clowes 和礼来团队已能生产出更大批量的胰岛素，但仍有杂质问题，并且显然没有达到全球需求的规模。
尽管选择与礼来公司合作，胰岛素专利还是以1美元价格转让给多伦多大学。在1922年6月3日的专利声明的早期版本中，麦克劳德（Macleod）和班廷（Banting）都拒绝签署专利。有报道说，Banting在宣誓希波克拉底誓言之后，觉得凭良心而言，他不能成为此专利的当事人。当时的医学生贝斯特（Best）和科利普（Collip）则并不认为有类似的道德困境，因此在最初的专利声明中被正式命名为胰岛素发明者。
到1922年夏末，礼来公司增加了胰岛素产量，但还需要进一步改进来提高产量和纯度。秋季的一项重大突破是化学家们应用等电点沉淀来生产胰岛素，而等电点沉淀法为大规模生产胰岛素提供了一种可靠方法。到1923年，几乎所有的胰岛素都是由美国礼来公司或加拿大康诺特实验室生产的。
1922年，丹麦动物生理学教授、诺贝尔奖获得者奥古斯特·克罗格（August Krogh）访问多伦多，了解关于胰岛素的知识。其兴趣既来自科学方面，也有个人方面因素，因为其妻子玛丽·克拉夫（Marie Krogh）是一名医生，自己患有糖尿病，也在治疗其他糖尿病患者。到1923年初， Krogh教授和丹麦化学家兼内科医生汉斯·克里斯蒂安·哈格多恩（Hans Christian Hagedorn）开始在丹麦哥本哈根的诺德胰岛素实验室（ Nordisk Insulin Laboratory）生产胰岛素，并成功地将其用于糖尿病患者。也是在这一年，诺和诺德生产的胰岛素开始在市场大量销售，使更多患者获得生存机会，这其中也有克罗格的妻子玛丽（Novo Nordisk (2020). The Founders.）。
胰岛素类似物的发展
在20世纪20年代，糖尿病患者通常每天接受3-4剂胰岛素。显然需要更长效的胰岛素来减少每日所需的注射次数。然而，核心问题是胰岛素作用的时间相对较短，需要每天多次注射。
到20世纪30年代中期，人们试图创造一种长效胰岛素。哈格多恩(Hagedorn，丹麦)是第一个成功的例子，其鉴定出鱼精蛋白可以添加到胰岛素分子中以稳定其结构[Proc R Soc Med 30(6):805–814；1937]。与此同时，多伦多的研究人员发现其他底物可以用来延长胰岛素的半衰期，最显著的是锌。这些进步使得长效胰岛素可以与最初提供的短效胰岛素结合使用。这些长效形式的胰岛素在20世纪40年代后期已经在临床开始广泛使用，而到20世纪50年代中期，作用更长的形式也出现(例如lente insulin，慢胰岛素锌混悬液)。
胰岛素类似物的下一个重要里程碑发生在1955年，当时英国生物化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）对胰岛素进行了测序。这是第一个完全测序的蛋白质，这一成就使Sanger获得1958年诺贝尔化学奖。胰岛素测序为从动物胰岛素向合成“人”胰岛素的转变铺平道路。随着重组DNA技术的发展，大量生产人胰岛素成为可能，不需要获得牛或猪胰腺。人胰岛素的产生从根本上解决了与抗胰岛素抗体发展相关的问题，这些抗体导致脂肪萎缩和抗体介导的胰岛素抵抗[Endocr Rev 41(5):733–755，2020]。
20世纪80年代，虽然临床上已经出现多种形式胰岛素，但接近生理胰岛素替代仍然困难。具体而言，就是需要用于进餐时使用的更快速起效的胰岛素，以及用于两餐之间或夜间提供基础量的更长效形式胰岛素。到20世纪90年代，第一种形式的快速作用胰岛素类似物(insulin lispro，赖脯胰岛素)被批准，到2000年，第一种真正的长效胰岛素类似物(甘精胰岛素，insulin glargine)被批准。此后胰岛素类似物的研发仍在继续，到目前为止，已经有多种新的胰岛素类似物，并且可能具有更好的药代动力学和药效学特性。1989年《新英格兰医学杂志》发表过一篇题为“胰岛素的生理替代:一个难以实现的目标（Physiologicreplacement of insulin: an elusive goal）”[N Engl J Med 321(6): 363–370；1989]的文章。32年后，如今胰岛素发现100年时，人类已经非常接近这一目标，但仍有很多问题需要解决。通过胰岛素类似物，已经能近似模拟胰岛素餐后反应和夜间基础需求等特征。然而，生理分泌的胰岛素会被释放到门静脉系统，肝脏中会获得高浓度胰岛素，并在肝脏代谢中发挥重要影响[ Drug Chem Toxicol 20( 4): 329–344；1997]，而这一过程很难复制，因为当皮下注射胰岛素时，肝脏和外周胰岛素浓度相似。除外周胰岛素浓度稍高外，目前仍不清楚这种差异是否有任何临床相关性。此外，胰岛素和血糖之间的调节与大多数激素系统一致，需要闭环反馈，设计胰岛素可以具有优越的药代动力学和药效学，但不能解决反馈和自动调节，而闭环泵装置的出现似乎成为曙光。
后记
Banting和麦克劳德（ Macleod）在1923年获得了诺贝尔生理医学奖。而这仅仅发生在其非凡成就的18个月后。Banting将奖金分享给学生助手贝斯特（Best），麦克劳德（ Macleod）则与克里普（Collip）分享其奖金。关于在胰岛素发现中，Banting团队各成员的贡献存在争议，但正如1988年的电视电影(根据迈克尔·布利斯（ Michael Bliss）的书《胰岛素的发现（The Discovery of Insulin）改变》[Bliss M(2007) The Discovery of Insulin: 25th Anniversary Edition. University ofToronto Press, Toronto])在为电影《Glory enough for all（共同的荣誉）》[Till E (Director). (1988)Glory Enough for All]命名时所描述的，这样非凡的荣誉已经“enough for all”，关键是，每个人的贡献足以被世人所铭记，无论是否获奖。事实上，研究小组的每个成员都对成功分离和临床应用胰岛素治疗糖尿病做出了重要和关键的贡献(图2).
图2 发现胰岛素的关键人物
麦克劳德（Macleod ）于1928年回到苏格兰，并在那里生活直至1935年去世。克里普（Collip ）在去加拿大麦吉尔大学(QC)之前回到了阿尔伯塔大学（Universityof Alberta），在那里他将成为第一批分离甲状旁腺激素的科学家之一。他还在1928年至1941年间担任该校的医学系主任，随后在1947-1961年间担任西安大略大学的医学系主任。
贝斯特（Best）继续对胰岛素生理活性进行研究，但并非仅限于此；20世纪30年代，Best团队世界上首次纯化肝素，这使得肝素可以安全地用于人类。1978年，贝斯特因主动脉瘤破裂去世，享年79岁。
在发现胰岛素后，Banting继续他的研究，而在第二次世界大战期间的1941年，Banting去英国的途中死于纽芬兰的一次飞机失事。
那个第一个成功注射胰岛素的14岁男孩伦纳德·汤普森（Leonard Thompson），他的生命延续了13年。虽然这与目前1型糖尿病患者的预期寿命相比相形见绌，但如果没有发现胰岛素，伦纳德可能不会拥有15岁生日。
100年前，1921年-1922年发生在多伦多的故事，吹响大规模反攻糖尿病的号角……
附录：1922年的文献
图示：Banting和Best早期胰岛素试验示意图
I am a firm believer in the theory that you can do or be anything that you wish in this world, within reason, if you are prepared to make the sacrifices, think and work hard enough and long enough. – Frederick Banting
内分泌医学史@CK医学
，但是，如果你是非内分泌专科医生，竟然也对这些内容如此感兴趣以至于看到了这两段PS的内容，甚至还想加群，那就按照PS中的步骤来吧，欢迎你
联系客服
