西湖大学鞠峰团队 ES&T：污水厂病原菌与土著反硝化细菌是多重抗生素耐药基因的活跃表达者

第一作者：袁凌

通讯作者：鞠峰

通讯单位：西湖大学

论文DOI：10.1021/acs.est.1c02483

研究摘要

抗生素抗性的日益增加和广泛传播给全球应对细菌感染形成了巨大的挑战。污水厂中蕴含和排放的抗生素抗性基因已被公认为新型的污染物。尽管如此，对于抗性基因的宿主身份、活性和功能习性的知识空白限制了对于污水处理厂中的抗生素抗性基因组的鉴定和风险评估。本文利用基于基因组解析的定量宏转录组学 (genome-resolved metatranscriptomics) 方法，定性和定量的分析了在12个污水处理厂中不同抗性基因细菌宿主的抗药性、病原性、活性和其功能。作者发现在恢复的248个基因组中，有约45%的基因组表达了多种类型抗生素的抗性基因。其中变形菌门细菌同时携带杆菌肽和氨基糖苷类抗生素抗性基因的现象尤为显著。群落中潜在病原菌和土著反硝化菌均为活跃的抗性基因宿主。文章结果显示，在污水处理厂微生物群落中存活了包括潜在病原菌在内的大量抗药群落，且其中大部分群落成员（66.9%）的抗性基因持续表达。该结论为未来污水排放的安全风险评估起到指导作用。  

材料与方法

1. 基于基因组的微生物组数据集分析

本文分析的47个微生物群落取样于12家瑞士的污水处理厂的初沉池，反硝化池，硝化池和二沉池出水 （取样时间为2016年3月- 4月）。关于具体的样品采集详情、高通量测序、污水厂运行参数可参考本文通讯作者的另外一篇文章：Ju, F.; Beck, K.; Yin, X.; Maccagnan, A.; McArdell, C. S.; Singer,H. P.; Johnson, D. R.; Zhang, T.; Burgmann, H. Wastewater treatment plant resistomes are shaped by bacterial composition, genetic exchange, and upregulated expression in the effluent microbiomes.ISME J. 2019, 13, 346-360。

2. 基于基因组解析的宏基因组数据分析

总体数据处理参考MetaWRAP (v1.2.2) 流程，总体而言，47个样品的序列被单独的组装和分箱。高质量的基因组（完整度-5*污染度≥50）通过dRep (v1.4.3) 去除重复的基因组，总共得到248个独特的高质量的组装基因组 （MAGs）。所有MAGs序列都上传至中国国家基因库（https:// db.cngb.org/，获取号：CNP0001328）。

3.  抗性基因的注释和移动性预测

组装基因组的抗性基因通过DeepARG (v2) 注释 （“--align --genes --prob 80 --iden 50）。结果得出在162个MAGs中共得到496个明确类型的抗性基因，在117个MAGs中找到了多抗性类型（multidrug）的抗性基因。根据注释结果，将248个MAGs分为多重抗性基因组（multi-resistant），单抗性基因组（single resistant）和无抗性基因组（non-resistant）。

考虑到可移动基因元件（例如：质粒）在抗性基因传播的过程中的重要作用，文章用 PlasFlow (v1.1)预测了在宏基因组数据中的质粒序列。同时通过hmmscan 对照pfam数据库，注释了数据集中的可移动遗传元件。通过抗性基因在基因组中的位置（在质粒上或临近可移动遗传元件），预测抗性基因的移动性。

4.  病原菌的鉴定

首先通过微生物物种分类鉴定结果与公共卫生领域所公认的病原菌属种（140 属和538种）进行对比，得到可能的病原菌。并将可能的病原菌与病毒力因子数据库（VFDB，2020年6月27日更新）进行比对，以确定其身份。

5. 硝化/反硝化功能基因注释

利用DIAMOND将MAGs中预测的基因与氮循环基因数据库进行比对，结果在88个MAGs中得到283个硝化/反硝化基因。

6. 基于基因组解析的定量宏转录组分析

基因组层面的定量分析：将每个样品的DNA 和RNA 序列联配至对应的重叠群（assembles）和基因预测集（gene libraraies）并计算覆盖度（coverage）。基因组的平均相对丰度和活跃度通过RPKM (reads per kilobase per million)表征。

基因绝对定量分析：为削弱相对定量分析的局限性，本文通过计算AEV（absolute expression values）对抗性基因表达进行了绝对定量分析。AEV 以transcripts/g-VSS 为单位，其具体计算公式为：

其中 N_{spiked RIS} 为样品中加入的内标的条数，m_biomass为样品的可挥发悬浮有机物质量，N_gene 为数据中得到的特定基因条代数，L_gene 是特定基因的长度，N_{RIS reads}是内标基因的条代数，L_RIS是内标基因的长度。更多关于定量宏基因组学与定量宏转录组学方法介绍请参考引文【45】：Huang, X. Y.; Zhang, L.; Yuan, L.; Ju, F*. Quantitative Metagenomics and Metatranscriptomics Methods of Microbiome.（微生物组的定量宏基因组学和定量宏转录组学方法） Bio-101 2021, e2003693。

本文还定义相对基因表达RER（relative expression ratio）：

其中median（AEV_SCMG）为GTDB-tk 定义的120个细菌的单拷贝标记基因AEV的中位数。文章定义RER大于1，则认为该基因较细菌中的看家基因（house-keeping gene）过表达。

结果与讨论

1. 污水厂微生物MAGs的总体概况

本文在47个样品中总共提取了1844个MAGs，经过质检和去重得到了248个独特的高质量的MAGs进行分析。恢复的MAGs分布在Proteobacteria (88),  Patescibacteria (68), Bacteroidota (39), Actinobacteriota (22), Firmicutes (11), 和 Myxococcota (4)等15个门类 （图1）。

图1 12个污水处理厂中获取的284个MAGs的系统发育树

2. 抗性基因的宿主身份、表达活性和可移动性

文章在248个MAGs中找到了162个携带抗性基因的宿主 （图2）。其中113个MAGs为多药抗性，49个MAGs为单药抗性。在多药抗性基因组中，W60_bin3基因组（Aeromonas media）拥有11个属于9个类型的抗性基因。从物种分类角度，在15个门属中，11个门的细菌拥有抗性基因组。其中Proteobacteria门拥有最多的抗性基因组。在该门88个基因组中有84个基因组拥有抗性基因（超过13个抗性基因类别），且绝大多数抗性基因都体现了转录活性。与Proteobacteria 相反，Patescibacteria门的基因组中只有少量的抗性基因组（10/68），且只有一个基因组有抗性基因转录活性。

在鉴定出来的496个抗性基因中有460至少在一个样品中具有转录活性。所检测到的抗性基因覆盖14个类型。其中杆菌肽和氨基糖苷类抗生素抗性基因最为常见，且主要寄宿于Proteobacteria。而β-内酰胺和膦胺霉素的抗药基因最为罕见。最活跃的的抗性基因是磺胺类抗性基因（2.53× 10¹¹transcripts/g-VSS）， 随后则为四环素抗性基因（1.51× 10¹¹transcripts/g-VSS）和多肽抗生素抗性基因(1.46× 10¹¹transcripts/g-VSS)。而氟喹诺酮类抗性基因最不活跃(1.42× 10⁹ transcripts/g-VSS)。多药性抗性基因的广泛存在和持续表达给污水厂的抗性风险评估敲响警钟。

图2 获取的MAGs中的抗性基因分布

另外结果在在质粒序列中找到了11个抗性基因，其中三个抗性基因被潜在病原菌携带。但由于细菌基因组长存在多个质粒，且种间差异不清晰，很多质粒都无法进行准确分箱。与此同时，结果还显示有35个抗性基因临近可移动遗传元件，为抗性基因提供潜在移动性。

3. 污水处理厂中病原菌的分布及其抗性分析

根据物种分类信息以及毒力因子比对，在群落中找到了20个潜在病原菌基因组，且多数（17）体现多药抗性。潜在病原菌在（由恢复MAGs所代表的）进水群落中可以占比47.3%的丰度和65.5%的活跃度。检测到的病原菌包含了Aliarcobacter cryaerophilus （3）， Aeromonas media（9），Acinetobacter johnsonii（4），Streptococcus （3）和Pseudomonas fluvialis（1）。进水中的病原菌在污水处理过程中几乎无法被检测到，但在出水中又重新被检测到。作者猜测，这些病原菌可能源于人类的排泄物的浮游细菌，在污水处理过程中没有完全被絮凝去除，残留的病原菌会随污水出水排放至受纳水体。

4. 生物氮循环与多病抗药性的交互关系

在污水处理微生物群落中按是否拥有氮循环功能基因筛选出88个具有氮循环功能潜力的MAGs（图3）。其中参与反硝化过程的细菌多样性（87 MAGs，5门）远高于硝化细菌（5MAGs，3门）。在反硝化细菌的群落中，8个MAGs拥有完整的反硝化路径，其余79个MAGs仅拥有部分路径。与不参与氮循环的细菌群落携带抗性基因的比率（10/86）相比，氮循环细菌携带一个或多个抗性基因的可能性明显更高（硝化菌，3/5和反硝化菌，75/87）。尤其是在硝化和反硝化过程中起到重要作用的Proteobacteria基因组中有65.9%的基因组具有多药抗性。文章作者推断在氮循环细菌编码的耐药基因有助于在污水中存在抗生素选择压力胁迫情况下维持污水处理厂的运行效率。

图3 MAGs中获取的氮循环功能基因以及其与抗性基因

5. 污水处理过程中抗性基因的活跃宿主

基因组数据分析结果显示大部分（18/20）的潜在病原菌高度表达抗性基因，占约38%的抗性基因表达，其中14个潜在病原菌参与到了反硝化过程。硝化菌总体来说不表达抗性基因，而反硝化细菌，尤其是土著反硝化细菌中的抗性基因高度表达。硝化与反硝化细菌在抗性基因表达上的不同体现了其在应对环境风险和生存策略的差异性（图4）。潜在病原菌和土著反硝化菌两个类群共占所有恢复MAGs中抗性基因总表达量约60%，是污水处理厂中抗性基因的重要宿主。

图4 污水处理厂中细菌抗性基因的绝对活性和相对活性

在不参与生物氮循环的抗性MAGs中，有35个MAGs 在除氮反应器中显著表达了抗性基因。根据文献对比，这些MAGs可能参与到活性污泥的絮凝和辅助氮循环细菌生长的作用。绝大部分的抗性基因活性可以在污水处理的过程被有效去除。然而，出水中仍然存在了121个有抗性基因活性的MAGs。其中有6个多药抗药的MAGs在出水中的抗性基因表达超过1 ×10¹⁰ transcripts/g-VSS。

对于抗性基因和氮循环基因的相对活性分析结果得出，抗性基因在污水处理过程中表达程度相对低（RER∼0.4）， 且在整个过程中变化不明显。氮循环功能基因被显著表达 （RER~4.6，反硝化 ~80.1 硝化），体现了氮循环在污水处理过程中的重要作用。

研究意义和重要性

该研究首次解析了污水处理过程中微生物抗生素抗性和脱氮功能的交互作用。同时通过基于基因组解析的定量宏转录组分析，深入探讨了抗性基因和氮循环基因在污水处理过程中表达程度。研究结论指出，污水处理的微生物群落中的病原菌和土著反硝化菌是抗性基因的主要宿主，且在污水处理过程中并未被完全去除。因此应对已处理的出水谨慎处置以免带来安全风险。同时，本研究首次建立了的基于定量性基因组解析分辨的绝对定量宏转录组的分析方法。该方法可以有效地规避了传统方法的局限性，可以准确的分析基因组和抗性/功能基因在不同样品中的丰度、活性和可移动性。该方法对未来工程微生物组研究的数据分析具有指导意义。

通讯作者简介

鞠峰，西湖大学研究员、博士生导师，环境微生物组与生物技术实验室（EMBLab）负责人，浙江省海岸带环境与资源研究重点实验室副主任，中国工程院院刊Engineering编委、Cell Press旗下The Innovation青年编辑、Frontiers系列Environmental Science、Microbiology、Bioengineering and Biotechnology期刊编委与审稿编辑，曾担任加拿大自然科学与工程理事会（NSERC）国际评审专家，国际微生物生态学会 (ISME) 、国际水协会 (IWA)、中国环境科学学会会员 (CSES)。2015年获香港大学工学博士学位，2015-2018年在瑞士联邦水科学与技术研究所 (EAWAG) 从事微生物生态与抗生素耐药方向博士后研究，2018年至今在西湖大学担任特聘研究员。鞠峰博士从事环境生物技术与微生物组学研究，曾获中国生态学会“水云天微生物生态青年科技创新奖-特等奖”（2018）、香港科学会“青年科学家奖”（2016）、香港大学“杰出研究型研究生奖”（2015）。目前参编“环境生物技术”主题英文专著章节2篇和“微生物组”主题中文专著章节5篇，在The ISME Journal (4 篇)、Environmental Science & Technology (9 篇)、Water Research (4 篇)、Science of the Total Environment (4 篇)等环境生态学与微生物学领域知名期刊发表学术论文40余篇，谷歌学术引用 3000余次。EMBLab实验室微信公众号：envmbio，主页: www.ju-emblab.com