清华大学和昆士兰大学ISME Communications：新型全程硝化菌的选择富集及代谢特征

成果简介

近日，ISME Communications创刊首期在线发表了来自清华大学汪诚文教授团队和澳大利亚昆士兰大学郭建华副教授团队、郑敏博士题为“Selective enrichment and metagenomic analysis of three novel comammox Nitrospira in a urine-fed membrane bioreactor”的研究论文。该论文报道了利用实际尿液废水成功富集到三种全新的全程硝化细菌（Complete Ammonia Oxidizer，Comammox Nitrospira）。通过宏基因组学分析揭示了这些新型全程硝化菌具有尿素利用的全部代谢途径。研究并指出尿液废水中的尿素促进了这些新型全程硝化菌的选择富集。该发现进一步更新了对参与氮循环微生物的认识。

图文导读

生物硝化过程是全球氮循环中的重要一环，该过程一直以来被认为是由氨氧化菌（Ammonia-oxidizing Bacteria, AOB）和亚硝酸盐氧化菌（Nitrite-oxidizing Bacteria, NOB）分两步来完成的。2015年，全程硝化菌（Comammox Nitrospira）的发现打破了对硝化过程的传统认知。全程硝化菌一种微生物能承担AOB和NOB的共同功能而独自将氨氮氧化为硝酸盐。目前，各国研究人员已经在多个生态系统和工程系统中检测到了全程硝化菌，如湿地、河床沉积物、饮用水系统、污水处理系统等。然而我们目前对全程硝化菌的认知仍处于初级阶段，尤其是对于如何富集培养全程硝化菌的关键条件仍不是十分清晰。

该联合团队通过将尿液废水作为膜生物反应器（Membrane Bio-Reactor, MBR）的进水，成功在200天内达到了全程硝化菌的富集（相对丰度高达30%）。该反应器表现出了良好的硝化效果，进水中总凯氏氮全部被氧化为硝酸盐氮，出水中无亚硝酸盐积累（图1b），最高去除负荷到了188 mg N·L⁻¹ ·d⁻¹（图1a）。16S rRNA扩增子测序结果表明该微生物群落中硝化螺菌属Nitrospira占主导地位，而传统AOB Nitrosomonas则在反应器运行至第161天后逐渐被淘汰，而Nitrospira的相对丰度最高上升至高于30%（图1c）。通过qPCR对不同种类amoA基因的变化结果进一步证明了富集的Nitrospira大部分是携带amoA的Comammox Nitrospira，而并非传统的NOB，它们的amoA基因拷贝数增加了4个数量级，而AOB和AOA的amoA基因拷贝数始终处在较低水平（图1d）。这些结果共同证明了全程硝化菌Nitrospira在以尿液废水为进水的MBR反应器中得到了选择性富集，并逐步淘汰了AOA和AOB。

图1 以尿液废水为进水的MBR反应器硝化效果及硝化菌群组成。a TKN去除负荷b 氨氮及亚硝酸盐转化c 基于16S rRNA基因扩增测序的Nitrospira 和 Nitrosomonas相对丰度变化d 基于qPCR的全程硝化菌Nitrospira、AOB和AOA amoA基因的变化

借用宏基因测序技术和生物信息分析，研究人员成功获得了三个全程硝化菌Nitrospira全基因组序列。通过对于这些基因组的注释分析，这三个全程硝化菌Nitrospira均同时携带了氨氧化和亚硝酸盐氧化的全部基因序列。根据系统发育分析的研究结果，本研究富集的全程硝化菌Nitrospira在进化发育上均属于Nitrospira的谱系Ⅱ中的CladeA，并且与已知的全程硝化菌对比平均氨基酸指数小于90%（图2），确定为全新的三种全程硝化菌。

图2 富集的全程硝化菌Nitrospira的系统发育树分析以及同其他全程硝化菌Nitrospira的平均氨基酸指数比较。

研究人员利用宏基因组技术进一步分析了全程硝化菌Nitrospira代谢尿素的潜能，试图揭示尿素诱导全程硝化菌富集的机理。分析结果证明这些全程硝化菌包含了利用尿素的完整路径，尿素转运基因urtABCDE，脲酶亚基ureABC，脲酶辅助基因ureDFGH（图3b）。在这个微生物种群中，源于全程硝化菌Nitrospira的ureC基因在所有的ureC基因中占比达到了41–66%，表明它们可能是MBR中代谢尿素的主要贡献者（图3a）。系统发育分析表明Nitrospira门中编码ureABC蛋白质的基因形成了一个深远的分支簇，说明了水解尿素是Nitrospira属一个古老的特性（图3c）。此外，本研究中富集的三株全程硝化菌Nitrospira的ureABC与其他分泌脲酶的Clade A成员在Nitrospira属中形成了一个单系簇（图3d）。

图3 MBR中微生物群落检测到的ure操纵子。a, 群落中含脲酶微生物的相对丰度。从三个宏基因组中提取所有的ureC基因，并通过计算特定ureC基因与所有检测到的ureC基因的比对片段数目估算它们的相对丰度。b, Nitrospira属中脲酶和尿素转运操纵子示意图。箭头代表基因，表示转录方向。c, 从所有公开可用的原核基因组中提取的编码ureABC蛋白序列的系统发育树。d, 从所有公开可用的Nitrospira属中提取的编码ureABC蛋白序列的系统发育树。这两个系统发育树都是用1000次bootstrap复制计算的，黑色圆圈表示bootstrap支持度为70%。

本研究还构建了新发现的全程硝化菌Nitrospira的代谢示意图（图4）。宏基因组学分析结果表明富集的全程硝化菌Nitrospira可以利用尿素作为替代氮源，在将尿素水解氨化为氨氮后，利用氨氮进一步进行硝化反应，最终转化为硝酸盐。目前通常认为富集全程硝化菌的条件包含低氨氮浓度和长SRT，本研究中反应器实现了总凯氏氮到硝酸盐的氧化，出水中基本不包含氨氮，保证了反应器中低氨氮的生长条件。同时，膜反应器在长时间运行中无刻意排泥，保证了长SRT条件，从而有助于全程硝化菌Nitrospira的富集。值得注意的是，反应器运行过程中保持溶解氧浓度在4 mg/L以上，说明低溶解氧条件不是富集全程硝化菌必要的。重要的是，本研究采用了尿液废水作为进水，而全程硝化菌包含尿素利用的完整基因，因此尿素的供给可能是全程硝化菌Nitrospira能够选择性富集的主要决定因素。

图4 MBR反应器中富集的全程硝化菌Nitrospira细胞代谢示意图。

本研究发表在Nature Publication Group旗下ISME Communications期刊上，参与该研究的作者还包括清华大学博士研究生白鸽和昆士兰大学刘涛博士和博士研究生李洁，以及来自于荷兰内梅亨大学的Mike Jetten教授和Sebastian Lücker博士。

作者简介

汪诚文：清华大学教授，博士生导师，环境学院给水排水工程教研所所长。长期致力于水污染治理研究，在源分离排水系统、废水生物脱氮与资源化、农村污水治理、黑臭水体治理等方面开展过长期和系统的研究。在国内外核心期刊发表学术论文100 余篇，获得专利40 余项。曾荣获全国优秀科技工作者，获国家科技进步二等奖1 项、教育部和环保部一/二等奖8 项。

郭建华：澳大利亚昆士兰大学副教授，水管理高等研究中心副主任(Deputy Director for Research, Advanced Water Management Centre, The University of Queensland, Australia)。分别于2012年和2017年荣获澳大利亚研究委员会DECRA Fellow和Future Fellow。研究领域主要包括新型生物脱氮技术，环境新型污染物的治理与控制，耐药基因在环境中的传播与控制，反硝化型甲烷厌氧氧化，以及水工程系统中微生物生态学，主持和参与多项澳大利亚科研基金项目。已出版专著1部，合作出版章节2章，发表SCI论文120余篇，其中8篇论文发表在The ISME Journal，论文引用次数超过4700余次。指导的博士生中已有9人获昆士兰大学博士学位，现指导博士研究生10余名。现为Water Science & Technology期刊Editor，Water Research和Journal of Hazardous Materials期刊Associate Editor。

郑敏：澳大利亚昆士兰大学水管理高等研究中心研究员(Research Fellow)。主要从事污水处理与资源化领域研究，近些年来在污水能源回收与自养脱氮革新技术、剩余污泥无害化和资源化的新途径、嗜酸性氨氧化微生物的氮循环新认知等方面开展了较为系统的基础理论与应用研究。近两年发表SCI论文30余篇，包含环境领域知名期刊Environmental Science & Technology 和Water Research论文10余篇。

第一作者：李继云为清华大学环境学院2016级博士研究生；花正双博士现任中国科学技术大学环境科学与工程系研究员。