❀ 研究背景 ❀
原发性肿瘤切除后无法检测到的播散性肿瘤细胞（DTC）的持续存在对有效的癌症治疗提出了重大挑战。这些持久的休眠DTC是未来转移的种子，将它们从休眠状态转换为生长状态的机制需要定义。由于癌症休眠为预防转移性疾病提供了一个独特的治疗窗口，因此全面了解休眠性DTC的分布、组成和动态是必要的。
在许多癌症患者中，原发肿瘤治疗成功后较长时间会出现转移。在没有转移性疾病证据的患者的骨髓中检测到播散性肿瘤细胞（DTC），并确定其预后重要性，表明从原发肿瘤中播散的癌细胞群可能在系统治疗后存活，并引发未来的转移。持续性DTC进入休眠的能力解释了不可预测的转移时间，是长期治愈的主要障碍；然而，是什么触发了从休眠到生长的转变尚不清楚。
休眠性DTC包含多种基因异常，但往往在很长一段时间内无法重新启动生长，这一事实表明，远处部位的微环境是转移进展时间的主导力量。这开启了一个令人兴奋的可能性，即通过防止休眠DTC库苏醒，恢复通常导致癌症慢性化的体内平衡机制可以作为治疗转移性疾病的新策略。衍生和实施这种微环境靶向疗法需要了解利用DTC生长的组织特异性开关的性质，而目前缺乏这种开关。
❀ 技术路线 ❀
❀ 研究结果 ❀
为了确定哪些微环境变化控制了DTC的生长，我们使用了乳腺癌的自发转移模型，该模型同时产生休眠疾病（即DTC库大部分保持静止）和转移。我们设计了MDA-MB-231细胞，以共同表达荧光素酶tdTomato和p27突变报告基因（mVenus-p27K）−) 识别静止细胞，将其植入NOD-SCID免疫低下小鼠的乳腺，切除原发肿瘤，并在切除后6周量化远处组织中的DTC和基质（图1a，b）。在每个组织中发现不同频率的DTC（图1c），并且在肝脏中优先处于静止状态（图1d）.对单个肝脏内DTC分布模式的分析揭示了不同疾病阶段的共存：少数转移区域大多含有循环DTC，而大多数器官显然无疾病，但仍以散在、基本上静止的单个细胞或小簇（少于10 个细胞））（图1e）分布。
图1
为了探讨DTC的不同命运是否源于器官内微环境的差异，我们对与休眠和转移相对应的肝环境进行了全转录组学分析，我们通过将不同小鼠的肝脏分割成更小的部分并分离其组成细胞群，通过荧光激活细胞分选（FACS）来检索（基质、静态和循环DTC）（图1f）。循环DTC富含与细胞分裂相关的转录物，而静止细胞显示WNT和维甲酸信号(之前报道与细胞休眠相关)， 休眠样本中上调的基因与宿主防御过程和NK细胞介导的反应相关（图1g）。我们发现，与无瘤肝脏相比，NK细胞是唯一在休眠环境中增加的免疫细胞类型，无论是在百分比上还是在细胞数量上（图1h）。鉴于在休眠和转移环境中观察到的NK细胞丰度的实质性差异，我们推断DTC遇到的NK细胞池可能对其觉醒有决定性影响。为了验证这种可能性，我们评估了在两种乳腺癌转移模型中调节NK细胞室的辅助疗法对DTC持续性和生长恢复的影响（图1i）。使用抗asialo-GM1抗体耗尽NK细胞加速了肝转移，相反，使用白细胞介素-15（IL-15）扩大NK细胞池完全防止了肝转移（图1j），但避免了休眠DTC库（图1k），NK细胞的增强转化为小鼠存活率的显著增加（图1l），证实了整个NK细胞池的持续功能能力等同于预防肝转移和提高生存率。
NK细胞通过IFNγ维持休眠状态
NK细胞如何维持癌症休眠需要阐明。由于静态DTC在NK细胞监测中存活下来，我们探讨了这些DTC是否如之前提出的那样，对NK细胞的识别和杀伤具有内在抗性。为了研究NK细胞如何强制休眠，我们对从不同肝脏环境中分离的NK细胞进行了全转录组分析（图2a）。休眠相关NK细胞与转移相关NK细胞相比，它们表现出许多细胞因子编码途径的上调（图2b），包括肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素-γ（IFN-γ），在活化的NK细胞中显著，并诱导肿瘤细胞生长停滞。为了评估这些细胞因子是否也会触发DTC休眠，我们对不同的肝脏环境进行了免疫分析，并验证了与无肿瘤和转移样本相比，在免疫受损和免疫活性模型中，处于休眠状态的IFNγ和NK细胞的频率增加（图2c）。为了阐明IFNγ对DTC静止的直接影响，我们制作了肝细胞和稀疏接种的癌细胞的共培养物（模拟肝脏中的活体DTC接种），并用重组IFNγ处理它们（图2d）。与小鼠研究一致，外源性 IFNγ仅在肝样环境中存在肝细胞的情况下显着增加静止 DTC 的比例（图2e，f）。这些结果表明NK细胞通过IFNγ诱导的静止来控制休眠的DTC。
图2
aHSCs引导NK细胞耗竭并促进肝转移
从转移性基质中挖掘我们的转录组数据，具有丰富的编码活化肝星状细胞（aHSCs）标记物的转录物（图3a），这是在癌症发生之前的纤维化的主要驱动因素。α-平滑肌肌动蛋白阳性（α-SMA）细胞的显着积累和仅在转移灶中发现的胶原沉积（图3b−d）证实aHSCs的出现是疾病进展的一个必要条件。这导致我们质疑HSC的激活是否会干扰NK细胞池的大小。通过使用四氯化碳31（CCl4）治疗HSC激活的已建立模型（图3e），我们发现aHSCs的积累特异性地增加了肝转移（图3f），并与NK细胞频率的严重下降平行（图3g）。这表明即使在没有DTC的情况下，aSC也会破坏NK细胞介导的免疫。在这两种情况下，观察到的NK细胞减少源于缺乏增殖（图3h）。这些数据表明，累积的aHSCs可以通过阻止NK细胞池的扩张来抑制NK细胞持续的癌症休眠。
图3
CXCL12介导肝星状细胞诱导NK细胞静止
为了确定aHSCs如何抑制NK细胞的增殖，我们转向了培养系统，NK-92 细胞暴露于来自肝细胞 (Heps) 和 aHSCs单独或混合组成的肝脏共培养物的条件培养基 (CM)，并通过 EdU掺入评估增殖（图4a）。我们发现，来自含有aHSCs的培养物的条件培养基显著降低NK细胞增殖率（图4b）。为了确定哪些因子介导aHSCs对NK细胞的功能活性，我们在aHSCs或肝细胞单独培养的条件培养基上进行了全蛋白质组学研究。aHSCs分泌组中最明显上调的蛋白质是趋化因子CXCL12（图4c），该蛋白先前通过其受体CXCR4参与造血转运和癌细胞向易转移组织的归巢。用来自 aHSC的条件培养基培养 NK 细胞产生更多的细胞在 G0-G1 中停滞，而添加阻断 CXCL12 功能的抗体中和了其对增殖的抑制作用（图4d）。IL-15水平的升高可诱导NK细胞增殖，从而确保有大量NK细胞通过IFNγ诱导的静止来控制休眠DTC。肝损伤导致HSC激活和CXCL12分泌，CXCL12通过其同源受体CXCR4保持并使NK细胞静止。CXCL12的NK细胞抑制功能增加了其作为DTC增殖诱导剂的典型效应，并有助于转移性生长(图4e)。
图4
NK细胞对转移性疾病的作用被广泛接受。传统的假设是癌细胞通过改变NK细胞用来区分恶性细胞和健康细胞的抑制和激活信号的表面序列来逃避NK细胞的监视。这种肿瘤固有免疫逃避策略已被提出用于控制癌症休眠；因此，一些DTC进入自我施加的静止状态，下调NK细胞激活剂并逃避NK细胞介导的细胞毒性。在这里，我们展示了一种替代的细胞抑制IFNγ介导的NK细胞免疫机制，这对控制乳腺癌休眠至关重要。在不排除NK细胞在体内产生细胞毒性作用的可能性的情况下，我们的数据反对对增殖性DTC的差异，并支持另一种观点，即NK细胞池的大小和肝脏亚微环境中IFNγ的可用性决定休眠和转移性生长。
我们的研究表明，DTC休眠是通过保持组织内稳态，特别是免疫和成纤维细胞内稳态来实现的，组织生理学的破坏为DTC提供了重新激活的机会。在患者中，这反映在老龄化过程中宿主防御能力的不断下降，但也反映在复发性感染和生活方式相关损伤（如酒精、肥胖和吸烟）引发部位特异性转移的风险增加。我们设想辅助性NK细胞免疫治疗是一种维持组织内环境稳定和预防转移性疾病的手段。
亮点：
1.构建了免疫缺陷及免疫正常小鼠自发性乳腺癌肝转移模型
2.阐明了NK细胞维持乳腺癌细胞休眠的具体机制，为肝转移提供了新的治疗思路
不足：
肝星状细胞活化后，导致的胶原沉积本身会导致肝脏微环境重塑为促转移状态，若在体内阻断CXCL12恢复NK细胞增殖活性，进而降低肝转移，可能更具说服力。
❀ 参考文献 ❀
Correia AL, Guimaraes JC, Auf der Maur P, De Silva D, Trefny MP, Okamoto R, Bruno S, Schmidt A, Mertz K, Volkmann K, Terracciano L, Zippelius A, Vetter M, Kurzeder C, Weber WP, Bentires-Alj M. Hepatic stellate cells suppress NK cell-sustained breast cancer dormancy. Nature. 2021 Jun;594(7864):566-571.
“一俯一仰一场笑，
一江明月一江秋。”
——陈沆《一字诗》
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