T细胞衰竭是癌症免疫治疗的主要障碍之一， 终末耗竭的CD8 TIL是一个增殖能力受损的亚群，对ICBS或大多数现有的免疫疗法不起作用。因此，在肿瘤微环境(TME)中重振终末耗竭的CD8 TIL亚群并发挥其治疗潜力仍然是一个重大挑战。所以，本文旨在研究IL-10对终末耗尽的CD8 T细胞的代谢重编程增强抗肿瘤免疫作用。
结果
01
IL-10–Fc reinvigorates terminally exhausted CD8 TILs
研究者首次制备了人IL-10和IgG1Fc的重组半衰期延长的融合蛋白(IL-10-Fc)，它可以与小鼠IL-10受体(IL-10R)26以剂量依赖的方式发生交叉反应。通过制作B16F10肿瘤模型，发现IL-10-FC联合ACT能显著增加CD8 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
接下来，研究者确定了对IL-10-FC治疗有反应的CD8 TIL的特定亚群。在所有CD8 T细胞中，终末耗竭的CD8 T细胞显著扩大。作者注意到，Tcf-1−TIM-3 亚群与PD-1 TIM-3 双阳性亚群完全一致。为了简化染色程序和分析，接下来使用表面抑制标记物PD-1和TIM-3来定义在随后的实验中终末耗竭亚群。
用IL-10-Fc处理后发现，它显着且选择性地扩增PD-1 TIM-3 双阳性但不扩增PD-1 单阳性细胞， 同时PD-1 TIM-3 T细胞也表现出BrdU、Ki67表达增加，说明IL-10-Fc处理后使终末衰竭亚群增殖能力增加。
接下来，研究者观察到，在所有CD8 α亚群中PD-1 TIM-3 CD8 T细胞上IL-10R亚基α(IL-10R)的表达水平最高。在当我们把IL-10Rα敲除后，CD8 T细胞对IL-10-FC的细胞扩增没有反应，这表明IL-10-FC信号直接通过IL-10R在T细胞上传递。同时扩增的PD-1 TIM-3 CD8 TIL保持了其产生细胞毒性分子颗粒酶B和其他效应分子的能力，并显示出更高的激活标记CD69、低的抑制性标记PD-1的表达水平。
总而言之，IL-10-Fc通过IL-10R促进终末耗竭的CD8 TIL的增殖和效应功能。
02
IL-10–Fc directly expands terminally exhausted CD8 TILs
在共转移实验中，研究者将PMEL和OT-I CD8 T细胞在B16F10肿瘤的小鼠中共注射。发现IL-10-Fc可显著增加PMEL中PD-1 TIM-3 双阳性细胞和总转移细胞的比例。这一结果表明，只有抗原特异性的(PMEL)终末耗尽的CD8 TIL对IL-10-FC有反应。接下来将从TIL中分选的PMEL T细胞的两个亚群(PD-1 TIM-3和PD-1 TIM-3 )转移到携带B16F10肿瘤的受体小鼠，发现在没有PD-1 TIM-3−、CD8 T细胞的情况下，PD-1 TIM-3 CD8 T细胞在体内显著扩增。说明IL-10-FC治疗后PD-1 TIM-3 细胞数量的增加主要是由于最终耗尽的T细胞的直接扩增，此外PD-1 TIM-3 CD8 T细胞数量的增加也不是由于细胞凋亡的减少而发生的。
研究者接下来利用了Tcf7DTR-GFP转基因的P14T细胞。它会在白喉毒素(DT)处理后，选择性地耗尽祖细胞） 随着祖细胞在体内耗尽，发现肿瘤中终末耗竭的T细胞亚群仍然对IL-10-FC治疗有反应，并扩大到与没有DT耗竭的小鼠相当的水平，这表明IL-10-FC治疗对最终耗尽的T细胞的扩增不依赖于祖细胞。
将识别gp33抗原的Tcf7DTR-GFP转基因P14T细胞转移到携带B16-gp33肿瘤的小鼠身上。在DT介导的祖细胞耗竭的情况下，ACT和IL-10-Fc联合治疗引起的肿瘤消退和疗效与未耗竭的T细胞相似，表明终末耗竭的T细胞直接对IL-10-Fc有反应，从而增强了抗肿瘤效果。
因此，IL-10-Fc以不依赖于祖细胞的方式扩增抗原特异性的终末耗竭的CD8 TIL。
03
IL-10–Fc promotes OXPHOS of T cells
受IL-10重新编程巨噬细胞代谢谱的观察启发，作者接下来研究了IL-10/IL-10R信号是否调节CD8 T细胞代谢，并阐明其潜在的机制。在用多肽冲击抗原提呈细胞或二聚化的抗CD3抗体刺激TCR时，初始和预备的CD8 T细胞在IL-10-Fc存在的情况下上调OXPHOS，基础耗氧率(OCR)增高。
为了模拟肿瘤抗原在TME中的持续刺激作用，作者建立了B16F10细胞与活化的PMEL CD8 T细胞共培养体系。经IL-10-Fc处理后的结果表明，当有持续的抗原刺激时，IL-10-Fc主动地将T细胞代谢重新编程为更高的OXPHOS依赖性。
此外，IL-10-Fc可显著促进T细胞增殖，在共培养实验中对B16F10靶细胞的杀伤率也显著提高，这表明促进OXPHOS增强CD8 T细胞的增殖能力。
接下来，在体外产生和分选的PMEL PD-1 TIM-3 CD8 T细胞表现出与整个CD8 T细胞群体相似的OCR水平和OCR/ECAR比值，并被IL-10-FC显著扩大。
04
IL-10–Fc potentiates ACT and ICB immunotherapies
IL-10-Fc扩大了终末耗尽的CD8 TIL，同时促进了它们的效应功能，这一发现促使研究者评估ACT免疫疗法与IL-10-Fc联合应用的抗实体瘤效果。
在B16F10肿瘤的治疗环境中，瘤周给予IL-10-FC和过继转移活化的PMEL CD8 T细胞(5×106)而不进行淋巴净化预处理的联合治疗，在90%的治疗小鼠中持续诱导肿瘤完全消退和持久治愈。相反，单用ACT治疗可以暂时控制肿瘤生长，但不能诱导肿瘤消退。在没有ACT的情况下使用IL-10-Fc可以根除30%的肿瘤。此外，作者发现在接受IL-10-FC联合ACT治疗的长期幸存者中，近80%在停止治疗2个月后抵抗了B16F10细胞的再次攻击，这表明诱导了抗肿瘤免疫记忆。
将表达OVA的小鼠黑色素瘤细胞皮下接种，接种至高肿瘤负荷时(大小为≥50mm2或150mm3)。ACT联合OT-I CD8 T细胞(5×106)和IL-10-Fc治疗可使肿瘤显著消退并最终消除，而单独ACT仅显示一过性的肿瘤生长抑制，没有持久的治疗效果。
接下来，将这种联合策略扩展到CAR-T细胞疗法，这是临床上一种重要的免疫疗法。研究者制备了靶向HER2的小鼠CAR-T细胞并接种了MC38-HER2肿瘤， IL-10-Fc佐剂辅助的CAR-T细胞ACT完全根除了肿瘤，并使90%的治疗小鼠得以持久治愈。在CAR-T细胞和IL-10-FC联合治疗后，100%排斥原发肿瘤的治愈动物也抵抗了MC38-HER2细胞的第二次注射。与其他免疫刺激细胞因子不同，IL-10-Fc单独或联合ACT治疗是安全的，且无明显毒性。
因此，IL-10-Fc显著且安全地增强了ACT和ICB免疫疗法，在大多数已建立实体瘤的小鼠中介导了强大而完整的反应和持久的治愈。
05
IL-10–Fc enhances OXPHOS of terminally exhausted CD8 TILs
为了了解IL-10-FC治疗如何调节体内终末耗尽的CD8 TIL的基因表达，作者对ACT与IL-10-FC或PBS对照治疗的B16F10肿瘤中分选的肿瘤抗原特异性Thy1.1 PD-1 TIM-3 CD8 TIL进行了RNA测序。发现IL-10-FC治疗导致肿瘤中CD8 T细胞的PD-1 TIM-3 亚群中的842个基因发生显著变化。
IL-10-Fc组PD-1 TIM-3 CD8 TIL高表达编码OXPHOS相关基因。接着，对IL-10-Fc和PBS对照组之间转录差异的基因集分析，提示T细胞OXPHOS和效应器功能相关的基因和途径十分丰富。
接着研究者分析了CD8 TIL的线粒体谱，发现IL-10-FC处理上调了PD-1 TIM-3 CD8 TIL中线粒体活性氧(ROS)的水平。并且IL-10-FC处理显著增加PD-1 TIM-3 CD8 TIL的基础OCR水平。
这些结果表明，在IL-10-FC作用下，终末耗竭的CD8 TIL经历了向OXPHOS的代谢重编程。
06
IL-10–Fc promotes OXPHOS in an MPC-dependent manner
接下来，研究者使用了几种途径特异性抑制剂来探索IL-10-Fc调节T细胞代谢的分子基础，发现用2-脱氧-d-葡萄糖(2-DG)抑制糖酵解或用UK5099抑制MPC阻断丙酮酸转运均可完全阻断IL-10-Fc的作用。这说明IL-10-Fc以MPC依赖方式促进T细胞OXPHOS和抗肿瘤免疫。因此得出结论：IL-10-FC诱导的代谢调节可能依赖于糖酵解产生的丙酮酸。
为了进一步验证这一假设，研究者将Mpc1花系小鼠(Mpc1fl/fl)与Cd4cre×OT-I转基因小鼠杂交，获得了MPC1基因缺失的OT-I小鼠。与野生型OT-I CD8 T细胞相比，MPC1-敲除OT-I CD8 T细胞不能对IL-10-FC刺激OXPHOS或细胞扩张作出反应。因此，IL-10-Fc以MPC依赖的方式促进T细胞的OXPHOS和线粒体功能。IL-10-FC在促进PD-1 TIM-3 CD8 T细胞增殖和细胞毒性方面的作用被OXPHOS PAN抑制剂的处理所取消，这表明诱导的代谢重编程对于IL-10-FC重振终末耗尽的T细胞是必要的。
接下来，研究者用丙酮酸钠作为IL-10-FC治疗的代谢重编程的替代方法直接注射WT OT-I CD8 T细胞，发现现CD8 T细胞数量增加，这表明代谢重编程可能是重振耗尽的T细胞的潜在机制。
07
Metabolic reprogramming is essential for T cell reinvigoration
为了证实依赖丙酮酸/MPC的OXPHOS对于终末耗尽的CD8 TIL的体内扩增和最终治疗结果是必不可少的，接下来作者将MPC1-KO OT-I CD8 T细胞或WT-I CD8 T细胞转移到小鼠体内，发现与WT OT-I CD8 T细胞相比，IL-10-Fc处理不能增加过继移植MPC1-KO OT-I CD8 T细胞的CD8 TIL总数或PD-1 TIM-3 T细胞亚群。并且过继转导的MPC1-KO OT-I CD8 T细胞和IL-10-FC联合应用对肿瘤生长的控制作用明显低于WT OT-I CD8 T细胞和IL-10-FC。
这些结果表明，依赖于MPC的代谢重编程对于IL-10-FC重振终末耗尽的CD8 TIL至关重要。
总结
T细胞衰竭是癌症免疫治疗的主要障碍之一，终末耗竭的T细胞对免疫检查点封锁没有反应，很难恢复增殖能力。在这里，作者显示半衰期延长IL-10-Fc融合蛋白通过促进氧化磷酸化直接和有效地增强终末耗竭的CD8 肿瘤浸润淋巴细胞的扩增和效应功能。IL-10-Fc是一种安全且高效的代谢干预措施，与过继性T细胞转移免疫疗法协同作用，可在大多数治疗小鼠中根除已建立的实体瘤并持久治愈。
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