背景介绍
铁死亡是一种铁依赖的非凋亡细胞死亡形式，由胱氨酸耗竭和大量脂质过氧化控制的膜损伤引起。铁死亡的调节失调与人类癌症密切相关，而且，铁死亡在肿瘤抑制中起着至关重要的作用。铁死亡受多种关键因子的调控，包括溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)。SLC7A11和Gpx4是铁死亡的抑制因子，并且以不同的途径抑制SLC7A11或Gpx4能够触发铁死亡。RNA结合蛋白(RBPs)是一类与RNA相互作用形成核糖核蛋白复合体的蛋白质，调节其靶RNA的命运，控制基因表达的各个方面，如RNA稳定性、前mRNA剪接、翻译等。最近，人们发现RBMS1可以直接结合其靶mRNA来调节RNA的稳定性，从而抑制结肠癌的转移。然而，RBMS1通过铁死亡相关基因的翻译调控参与肺癌的研究尚未见报道。在本文，将系统地鉴定了RBMS1是肺癌中SLC7A11的翻译促进因子，并揭示了这种RNA结合蛋白的缺失会刺激铁死亡，从而抑制肺癌细胞的生长，并使肺癌细胞对放射治疗增敏。
研究结果
1.系统鉴定RBMS1是肺癌铁死亡的关键调节因子
首先，利用shRNA文库对大约200个RBP进行了RNAi筛选。然后使用erastin在RBPs缺失的肺癌细胞中诱导铁死亡，然后测量细胞对铁死亡诱导反应的活力(图1A)。发现多个RBPs可以参与调控铁死亡，随后选择了前10个候选RBPs进行进一步验证(图1B)。RNA结合蛋白RBMS1被鉴定为主要影响铁死亡的顶部蛋白(图1B)。如图1C所示，RBMS1缺失的A549肺癌细胞对erastin诱导的铁死亡非常敏感，而这种敏感性被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 (ferr1)所阻止(图1C)，表明RBMS1缺失促进了肺癌细胞的铁死亡。
为了进一步研究RBMS1在铁死亡中的潜在作用，作者用两个独立的shRNA构建了RBMS1稳定耗竭的H1299肺癌细胞，并发现RBMS1的敲除显著增加了erastin触发的脂质过氧化(图1D)。一贯地，CRISPR介导的RBMS1缺失也增加了Erastin诱导的H1299肺癌细胞的脂质过氧化。透射电子显微镜(TEM)分析进一步显示，RBMS1耗竭的肺癌细胞线粒体缩小，膜密度增高，这是典型的铁死亡的形态学特征(图1E)。在RBMS1缺失的H1299细胞中也观察到了类似的结果，用结构照明显微镜(SIM)方法用已知的线粒体跟踪器探针Rho123染色(图1F)。
图1.
在功能上，在不同的肺癌细胞中，RBMS1的减少显著促进了Erastin诱导的细胞死亡(图2A)，而FERR-1可以阻止这种死亡(图2B)。作为对照，凋亡抑制剂和自噬抑制剂都不能抑制Erastin触发的不同RBMS1稳定耗竭的肺癌细胞(H1299和A549细胞)中细胞死亡的增加(图2C-2D)，表明在稳定耗竭的肺癌细胞中，Erastin引发的细胞死亡不依赖于凋亡和自噬。在肺癌细胞中敲除RBMS1也得到了类似的结果
为了进一步证实RBMS1缺乏使肺癌细胞对铁死亡敏感，用活性氧诱导剂叔丁基氢过氧化物(TBH)作为对照，并用RBMS1基因敲除的肺癌细胞诱导铁死亡。H1299细胞中RBMS1的缺失显著增加了细胞死亡，这也可以被铁死亡抑制剂FERR-1显著抑制，但不能被凋亡抑制剂Z-VAD-fmk或自噬抑制剂3-MA抑制(图2E)。此外，RBMS1基因敲除也使H1299细胞对低胱氨酸介质诱导的铁死亡敏感，这种敏感性被FERR-1完全挽救(图2F-2G)。随后将RBMS1重新表达回稳定缺失RBMS1的H1299细胞，显著逆转了Erastin诱导的铁死亡，并显著减少了细胞死亡(图2H-2I)。总之，结果表明RBMS1的缺失刺激了肺癌细胞的铁死亡。
2.RBMS1与人和小鼠肺癌进展和预后相关
作者发现RBMS1是肺癌细胞中铁死亡的关键调节因子。作者用免疫组织化学(IHC)染色方法检测了含有肺癌组织(n=60)和匹配的相邻肺组织(n=60)的组织芯片(TMA)连续切片中RBMS1的表达(图3A)。具体地说，超过50%的肺癌样本表现出RBMS1的强或超强染色，而只有不到5%的邻近肺组织表现出RBMS1的强或超强染色(图3B)。此外，RBMS1高表达的肺癌患者通常具有较高的临床分期肿瘤，表明RBMS1的表达水平与肺癌患者的临床分期呈正相关。此外，RBMS1水平相对较高的肺癌患者的总存活率比RBMS1水平较低的患者短(图3C)。因此，临床观察表明RBMS1是一个潜在的肺癌预后因子。
接下来，作者使用条件RBMS1基因敲除(CKO)品系研究了RBMS1对小鼠肺癌进展的影响，在CKO品系中，纯合子的Rbms1等位基因(Rbms1fl/fl)与LSL-KrasG12D/WT背景(KrasG12D/WT/Rbms1fl/fl)杂交，KrasG12D/WT/Rbms1WT作为对照。值得注意的是，当在AAV-CRE感染后3、5和8周用冠状和横断面微型计算机断层扫描(Micro-CT)进行成像时，雌性和雄性KrasG12D/WT/Rbms1fl/flCKO小鼠比KrasG12D/WT/Rbms1WT小鼠肺部可检测到的结节要少得多(图3D)。进一步的肿瘤分析显示，与KrasG12D/WT/Rbms1WT小鼠相比，KrasG12D/WT/Rbms1fl/fl CKO小鼠的肿瘤面积和肿瘤负担显著减少(图3E)。正如预期的那样，与KrasG12D/WT/Rbms1WT小鼠的肿瘤组织相比，KrasG12D/WT/Rbms1fl/fl CKO小鼠的肿瘤切片显示RBMS1水平显著降低，但IHC染色显示4-羟基-2-壬基(4HNE)水平增加(图3F)。因此，与从临床样本中观察到的结果一致，即RBMS1的缺失显著地抑制了肺癌的进展，并且这种抑制与铁死亡志物(4HNE)染色的增加有关。
图3.
3.RBMS1基因缺失抑制培养细胞肺癌进展
作者进一步检测了一组肺癌细胞系的RBMS1水平，发现多个肺癌细胞系的RBMS1水平显著增加(图4A)。RBMS1的缺失显著抑制了H1299和A549肺癌细胞的生长(图4B)。此外，克隆形成实验表明，RBMS1基因敲除显著抑制了H1299和A549肺癌细胞的锚定依赖性生长(图4C)。根据EDU染色判断，这种RBMS1基因敲除诱导的生长抑制与H1299和A549肺癌细胞的显著增殖抑制有关(图4D)。在RBMS1缺失的H1299和A549肺癌细胞中也观察到类似的生长抑制。同样，RBMS1缺失导致的生长抑制可以被铁死亡抑制剂FERR-1和Liproxstatin-1(Lip)部分挽救，但不能被其他细胞死亡抑制剂拯救，这表明RBMS1的缺失以铁死亡依赖的方式抑制细胞生长。然后，作者将携带有多西环素诱导的RBMS1shRNA的H1299肺癌细胞注射到裸鼠的侧翼，然后用或不加含有多西环素的水喂养它们以耗尽RBMS1(图4e)。与在体外的观察一致，缺失RBMS1的H1299细胞生长速度比对照细胞慢得多，并且与对照细胞相比发展出更小的肿瘤(图5F-5H)。因此，RBMS1的缺失抑制了培养细胞和异种移植瘤中肺癌的进展。
图4.
4.RBMS1缺失部分通过减少SLC7A11和随后的铁死亡激活来抑制肺癌进展
作者使用具有多西环素诱导的RBMS1耗尽或过表达的肺癌细胞进行定量蛋白质组学测定。有趣的是，当RBMS1耗尽时，SLC7A11的蛋白质水平显着降低（图5A）。证实了通过稳定或瞬时敲低，RBMS1耗尽的H1299和A549肺癌细胞中SLC7A11的表达显着降低，然而，其他铁死亡调节因子的水平没有受到影响（图5B）。相反，在H1299和A549细胞中，RBMS1的稳定过表达提高了SLC7A11的表达水平，但没有提高其他铁死亡调节剂的表达水平（图5B）。此外，用RBMS1稳定消耗在肺癌细胞中重新表达RBMS1挽救了RBMS1减少诱导的SLC7A11减少。由于SLC7A11调节细胞外胱氨酸的摄取，随后检查了胱氨酸摄取，发现敲低RBMS1显着降低细胞外胱氨酸的摄取（图5C）并显着降低GSH水平（图5D）。在具有多西环素诱导的RBMS1消耗的H1299肺癌细胞中也获得了类似的结果。此外，耗尽的RBMS1显着升高脂质过氧化（图5E）。重要的是，RBMS1敲低或RBMS1缺失的H1299肺癌细胞中SLC7A11的恢复几乎完全抑制了erastin触发的细胞死亡（图5F-5H）。
图5.
值得注意的是，SLC7A11在RBMS1缺失的H1299肺癌细胞中的重新表达抑制了低胱氨酸培养基引发的脂质过氧化(图6A)，并逆转了低胱氨酸培养基诱导的细胞死亡(图6B和6C)。此外，在缺乏半胱氨酸的RBMS1缺失细胞中加入NAC可以挽救RBMS1缺失诱导的癌细胞生长抑制，这表明这种作用依赖于通过SLC7A11摄取胱氨酸。综上所述，数据表明RBMS1的缺失主要通过抑制SLC7A11的表达来促进铁死亡，并进一步提示RBMS1的减少可能至少部分是通过抑制SLC7A11和促进铁死亡来抑制肺癌的进展。
图6.
作者用表达SLC7A11的构建体或对照载体稳定地转染了RBMS1缺失的H1299和A549肺癌细胞。在RBMS1稳定耗尽的肺癌细胞中，SLC7A11的恢复部分恢复了RBMS1基因敲除诱导的细胞生长抑制(图6D)。此外，克隆形成实验和EDU染色显示SLC7A11重新表达可显著促进RBMS1缺失肺癌细胞的增殖能力(图6E-6F)。一贯地，通过SLC7A11的修复或铁死亡抑制剂Liproxstatin-1的治疗，RBMS1耗竭引起的异种移植瘤发展的抑制也得到了显著的挽救，这表明这种肿瘤抑制也依赖于异种移植小鼠模型中的铁死亡(图6G-6I)，4HNE免疫组化染色进一步检测脂质过氧化反应显示，RBMS1缺失的肿瘤与对照肿瘤相比，4HNE染色增加，但SLC7A11重新表达后这种增加明显减少(图6J)。综上所述，结果表明RBMS1的缺失在体外和体内都部分通过抑制SLC7A11和促进铁死亡来抑制肺癌的进展。
5.RBMS1调控SLC7A11的翻译
此前，RBMS1已被证明作为RNA稳定性的转录后调节因子来调节基因表达。因此，作者试图研究RBMS1是否影响SLC7A11的mRNA表达。令人惊讶的是，根据qRT-PCR的判断，在稳定耗尽的RBMS1肺癌细胞和瞬时用siRNAs击倒肺癌细胞中，SLC7A11的mRNA水平都不受RBMS1的影响(图7A)。结果表明RBMS1可能在RNA后水平调节SLC7A11的表达，包括翻译。
图7
为了直接检测RBMS1是否调控SLC7A11的翻译，使用来自SLC7A11的不同启动子和UTR片段生成了四个翻译报告(图7B)。荧光素酶报告发现枯竭的RBMS1显著抑制了肺癌细胞中荧光素酶报告基因SLC7A11-Fluc-FL的活性，但对SLC7A11-Fluc-FL的mRNA水平没有影响(图7C)。此外，在RBMS1缺失的肺癌细胞中，只有荧光素酶报告分子SLC7A11-Fluc-T3的活性受到显著抑制(图7D)，这表明RBMS1通过其3'UTR的后半部分(T3区域)调节SLC7A11蛋白的翻译。而且在T3区发现了多个RBMS1结合位点，部分结合位点的截短突变不能完全取消这种抑制功能。此外，重新表达RBMS1推翻了RBMS1耗竭诱导的报告分子SLC7A11-flucT3的荧光素酶活性抑制(图7E)。进一步通过Ribo-Seq分析对主动翻译的mRNA进行了分析，发现了一些主动翻译的mRNA，它们的翻译可能受RBMS1的控制，其中SLC7A11是最重要的目标之一(图8)。与此一致的是，免疫荧光分析显示RBMS1与ER标记Calnexin共定位，提示RBMS1可能定位于ER以调节翻译。综上所述，结果表明RBMS1能够通过其3’-UTR下游区域促进SLC7A11的翻译。
图8.
6.RBMS1与eIF3d相互作用，连接SLC7A11的3'和5’UTR，促进其翻译
作者从稳定表达RBMS1的细胞中提取了含有RBMS1的免疫复合物，并用质谱分析了其相关蛋白。总共有118种蛋白质被特别鉴定。当使用基因本体分析潜在的RBMS1相互作用蛋白的细胞功能时，发现相互作用蛋白大多富集在多个与翻译相关的途径中，包括翻译调节、翻译启动和核糖核蛋白的生物发生(图9A)。进一步的STRING分析表明，RBMS1相互作用的蛋白质在功能上聚集在几个连接良好的相互作用网络中，包括预期的RNA处理亚群(图9B)。然而，参与翻译调控的蛋白质形成了另一个主要的亚群(图9B)。因此，结果进一步证明RBMS1可能通过调控翻译来调控SLC7A11的表达。
值得注意的是，在以外源表达的RBMS1为诱饵的免疫沉淀(IP)联用质谱分析中，鉴定出了多种关键的翻译调控因子。在共IP实验中，外源表达的eIF3d、eIF3i和eIF3m分别可以下调内源RBMS1(图9C)。相反，外源表达的RBMS1也分别下调了H1299和A549细胞中的内源性eIF3d、eIF3i和eIF3m(图9D)。EIF3d、eIF3i和eIF3m的表达水平不受RBMS1的影响。有趣的是，RBMS1和eIF3m之间的相互作用依赖于RNA，因为RNase处理在Co-IP分析中取消了它们之间的相互作用(图9E)。此外，使用纯化蛋白进行的体外下拉实验显示，GST-RBMS1下调了His-eIF3d，但不下调His-eIF3i或His-eIF3m，表明RBMS1能够直接与eIF3d相互作用(图9F)。重要的是，邻近连接分析(PLA)证实RBMS1确实与细胞质中的内源性eIF3d相互作用(图9G)。综上所述，数据表明RBMS1可能通过直接与eIF3d相互作用来调节SLC7A11的翻译。
图9.
为了检验这种可能性，作者将eIF3d与SLC7A11的荧光素酶报告基因一起过表达。正如预期的那样，过表达eIF3d显著促进了肺癌细胞中荧光素酶报告基因slc7a11 - flc - t3的活性，而不是slc7a11 - flc - t2的活性(图10A)。有趣的是，在RBMS1耗尽的细胞中，eIF3d诱导的SLC7A11- flc - t3报告蛋白的激活被抑制(图10B)，表明eIF3d对SLC7A11的翻译激活依赖于RBMS1。相反，eIF3d的消耗显著降低了SLC7A11的蛋白水平，并抑制了RBMS1诱导的SLC7A11的增加(图10C-10D)。综上所述，结果表明eIF3d在RBMS1调控的SLC7A11翻译中发挥了重要作用。
图10.
翻译调控因子通常结合靶基因的5'-或3'- UTR来调控翻译。因此，作者对RBMS1或eIF3d稳定过表达的A549和293T细胞进行了RNA-IP检测。RBMS1和eIF3d结合在SLC7A11的5’- UTR和3'- UTR上(图10E-10F)。但是，RBMS1的缺失使得eIF3d与SLC7A11的3’-UTR的结合失效，而与SLC7A11的5’-UTR的结合失效，说明eIF3d与SLC7A11的3’-UTR的结合是通过与RBMS1的相互作用而实现的(图10G)。此外，下调eIF3d几乎破坏了RBMS1与SLC7A11的5’-UTR的结合，但并未破坏SLC7A11的3’-UTR，说明RBMS1与SLC7A11的5’-UTR结合是通过与eIF3d相互作用(图10H)。因此，数据表明eIF3d通过RBMS1与SLC7A11的3’-UTR相关，而RBMS1通过eIF3d与SLC7A11的5’-UTR结合。综上所述，结果支持RBMS1与eIF3d复合物结合，连接SLC7A11的3’-和5’- UTR的模型，从而促进SLC7A11的翻译(图10I)。
7.RBMS1与临床样本中SLC7A11升高呈正相关，并表明肺癌细胞对放疗的耐药
由于RBMS1缺失诱导的SLC7A11翻译抑制促进铁死亡并抑制肺癌进展，作者检测了7例患者手术收集的成对非小细胞肺癌(NSCLC)标本和邻近正常组织中RBMS1和SLC7A11的表达。值得注意的是，所有非小细胞肺癌组织中的RBMS1和SLC7A11蛋白水平均显著高于相应的癌旁正常组织(图11A)，且SLC7A11和RBMS1在临床标本中的表达水平呈正相关(R2=0.893，P<0.0001)(图11B)。使用图3A中使用的相同组织微阵列(图11C)，通过IHC染色验证了这种观察。重要的是，超过50%的肺癌样本显示SLC7A11呈强或超强染色，然而，只有不到5%的邻近肺组织显示出SLC7A11的强染色(图11D)。此外，SLC7A11表达水平高的肺癌患者可能具有较高的临床分期肿瘤，提示SLC7A11的表达水平与肺癌患者的临床分期呈正相关。此外，SLC7A11水平相对较高的肺癌患者比SLC7A11水平较低的肺癌患者总生存期更短(图11E)。因此，临床观察显示，肺癌患者标本中RBMS1与SLC7A11呈正相关，进一步证明RBMS1在肺癌中的临床价值是通过调节铁死亡来实现的。
图11.
此外，通过IHC染色判断，来自KrasG12D/WT/Rbms1F1/fl CKO小鼠的肿瘤切片显示SLC7A11水平显着低于来自KrasG12D/WT/Rbms1WT小鼠的肿瘤组织中的水平（图11F），进一步证实RBMS1缺陷抑制肺癌发展与SLC7A11在小鼠中的表达降低有关。还从Rbms1fl/fl小鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），并发现通过蛋白质印迹分析判断具有RBMS1缺失的MEF具有显着的SLC7A11降低（图11G）。在功能上，RBMS1的缺失显着促进了erastin诱导的细胞死亡，这可以通过Ferr-1在MEF细胞中预防（图11H）。因此，数据支持RBMS1部分通过SLC7A11诱导的小鼠逃避铁死亡促进肺癌进展的观点。
已有研究表明，电离辐射(IR)可诱导铁死亡，而SLC7A11主要通过抑制铁死亡来提高抗辐射能力。作者观察到SLC7A11在肺癌细胞和小鼠中受RBMS1的翻译控制，这增加了RBMS1的缺失可能通过抑制SLC7A11的表达和促进铁死亡而使IR耐药的肺癌细胞对放疗部分敏感的可能性。为了验证这一可能性，使用了IR耐药的A549肺癌细胞，发现RBMS1在IR耐药的A549细胞中表达水平升高(图12A)。与亲代细胞相比，IR抵抗细胞中的SLC7A11水平也升高(图12A)。有趣的是，在抗ir的A549细胞中，RBMS1的下调降低了SLC7A11的水平(图12B)，诱导了更多的脂质过氧化(图12C)，并显著使这些细胞对辐照敏感(图12D)。同样，在IR抵抗的A549细胞中，ferl -1处理逆转了RBMS1诱导的辐射敏化损失(图12E)。同样，下调RBMS1对H1299癌细胞的辐射敏感性具有协同作用。总的来说，数据表明在临床样本中，RBMS1与SLC7A11升高呈正相关，并使肺癌细胞对放疗产生耐药性。研究结果进一步表明，RBMS1-SLC7A11轴可能是肺癌放疗致敏的一个潜在的新治疗靶点。
图12.
8.盐酸去甲替林通过促进铁死亡抑制RBMS1的表达及增敏IR肺癌细胞对放疗的敏感性
作者进行了一项化学筛选，利用包含1280种药物的美国药物集合，系统地识别可能促进铁死亡的RBMS1抑制剂。并且建立了稳定表达EGFP-RBMS1融合蛋白的H1299肺癌细胞，然后将这些细胞与不同的化合物孵育12小时(2µM)(图12F)。总共确定了八种化合物可以降低EGFP-RBMS1的荧光(图12G)。盐酸去甲替林(NTP)，一种抑制血管KV通道的抗抑郁剂，是抑制RBMS1表达的最重要的药物之一(图7O)。证实了NTP降低了肺癌细胞中RBMS1的水平，并显著抑制了荧光素酶报告基因SLC7A11-Fluc-T3的活性(图12H)。
重要的是，NTP抑制了IR耐药A549肺癌细胞中RBMS1的表达，并降低了SLC7A11的水平(图12I)，而不影响其他铁死亡相关因子的表达。此外，NTP显著促进了erastin诱导的细胞死亡，可被铁死亡抑制剂Ferr-1挽救，说明NTP处理也可刺激铁死亡(图12J)。因此，与使用载体治疗的细胞相比，NTP治疗使抗IR的肺癌细胞对辐射敏感(图12K)。总之，数据表明通过NTP抑制RBMS1可使IR耐药的肺癌细胞对放疗增敏，通过促进铁死亡为肺癌患者提供一种新的有效治疗药物。
总结
在本文，报道了RNA结合蛋白RBMS1通过介导铁死亡逃避参与肺癌的发生。通过shRNA介导的系统筛选，发现RBMS1是一个关键的铁死亡调节因子。临床上，RBMS1在肺癌中升高，其高表达与患者生存期降低有关。相反，RBMS1的缺失在体内和体外都抑制了肺癌的进展。从机制上讲，RBMS1与翻译起始因子eIF3d直接相互作用，连接SLC7A11的3'和5'UTR。RBMS1抑制SLC7A11的翻译，减少SLC7A11介导的胱氨酸摄取，促进铁死亡。在一项针对RBMS1的药物筛选中，进一步发现盐酸去甲替林能降低RBMS1的水平，从而促进铁死亡。重要的是，RBMS1的耗尽或被盐酸去甲替林抑制会使放射抵抗的肺癌细胞对放射治疗敏感。研究结果证实RBMS1是铁死亡的翻译调节因子，并且是一个具有治疗潜力和临床价值的预后因子。
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