从理论上讲，新辅助/辅助免疫疗法可能会引发有效的全身免疫，这可能在根除手术切除的原发肿瘤后有效地根除残留的转移性疾病。为了研究不同的手术和免疫疗法治疗功效如何影响转移和生存，我们采用了三阴性乳腺癌（TNBC）的两种模型，即4T1.2和E0771乳腺癌细胞系。在乳腺脂肪垫中接种4T1.2肿瘤后，小鼠在肺，肝，骨和脑等其他器官中发生广泛的转移。同样，接种E0771的小鼠在切除原发肿瘤之前会在肺部产生致死性转移。通过外科手术切除了原发肿瘤，然后将这些小鼠用目标药物进行治疗，以评估辅助治疗如何影响转移和生存。这两个临床前肿瘤模型通常用于模拟残余转移性疾病的手术和辅助治疗的临床环境。我们证明了在两种TNBC模型中，在原发肿瘤切除的背景下，新辅助治疗的疗效远高于辅助免疫治疗。
第一部分 anti-DT & anti-CD25a（新辅助>辅助免疫治疗）
调节性T细胞（Treg）（CD4 FOXP3 ）抑制免疫细胞的抗肿瘤活性，所以Treg的减少可以代表有效的免疫治疗。
实验动物：BALB / c FOXP3-GFP-DTR（FOXP3-DTR）小鼠同时表达GFP、表达DT受体。表达GFP是为了检测Treg T细胞，表达DTR是为了是为了DT治疗后人为耗竭TregT细胞。
实验建模：4T1.2肿瘤细胞（三阴乳腺癌）注射入小鼠体表脂肪垫
实验组1：0天建立肿瘤模型，第10日新辅助注射DT，制造条件性TregT耗竭模型，第13日手术
实验组2：0天建立肿瘤模型，第13日手术，第16日辅助注射DT，制造条件性TregT耗竭模型
对照组：PBS注射
结果：新辅助Treg耗竭小鼠生存有明显优势。
为了确定辅助和新辅助Treg耗竭实验小鼠4T1.2肿瘤负荷的差异，我们在接种肿瘤30天取出的这些小鼠的肺中进行q-PCR，以检测gp70表达（肿瘤中广泛表达，正常组织中无）。
Gp70检出率：
对照组（4/5）
辅助Treg耗竭（3/5）
新辅助Treg耗竭（0/5）
临床上不能直接做到精准的Treg耗竭，所以作者尝试可否用anti-CD25 mAbs制造Treg耗竭模型达到相同的效果。因为Treg高表达CD25，所以这也是一种方法。如图2，结果与实验一相似，同样证明了术前新辅助T耗竭优于术后辅助T耗竭。
重要的是，新辅助Treg耗竭对转移和长期生存的改善效果主要取决于原发肿瘤的切除（图1C）。由于原发性肿瘤的最终生长，未接受手术的新辅助Treg耗竭小鼠无法长期存活
第二部分 PD-1 & anti-CD137（新辅助>辅助免疫治疗）
为了确定上述发现是否是由于Treg耗竭引起的，还是这些发现也适用于目前临床上正在使用的免疫疗法，我们接下来比较了新辅助疗法和抗PD-1辅助疗法
结果：与接受辅助抗PD-1的小鼠相比，新辅助抗PD-1的小鼠显示出明显更长的生存期
在基础实验以及临床试验中，联合免疫治疗显示出更好的疗效。
CD137是在激活的T细胞和自然杀伤（NK）细胞上选择性表达的一种共刺激受体（30），并且已证明抗CD137在小鼠肿瘤模型中特别有效。此外，在临床试验中，单独的抗CD137药物已显示出一定的疗效，目前正在多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤中进行联合测试。
接下来，我们进行类似于图2A的实验，以测试新辅助药物或与抗CD137组合使用抗PD-1的新辅助药物的抗肿瘤功效
结果：与接受辅助抗PD-1 抗CD137的小鼠相比，接受新辅助抗PD-1 抗CD137的4T1.2荷瘤小鼠具有长期生存
有趣的是，与4T1.2肿瘤模型不同（图2A），单独的抗PD-1辅助治疗无效，而新辅助抗PD-1不能延长总生存期（图2D）。相反，与用辅助抗CD137治疗相比，单独使用新辅助抗CD137显着延长了治疗小鼠的存活期（图2D）。
第三部分 新辅助免疫疗法的疗效提高并非归因于转移瘤负荷的差异
接下来，我们希望消除新辅助免疫疗法的疗效提高仅是由于治疗时小鼠转移负荷的差异所致。因此，我们建立了一系列实验，其中我们改变了新辅助疗法和辅助免疫疗法的给药时间表。
首先，我们将新辅助DT延迟至接受辅助DT的小鼠（第16天）的同一天仍可导致35％（7/20）长期存活，而辅助Treg耗尽的小鼠仅有5％（1/20）存活。
此外，我们还证明，在正常接受时间表新辅助或辅助DT的时候，荷瘤4T1.2小鼠的肺部转移负荷（通过gp70表达水平来衡量）是相似的。
接下来，当我们又换了一种给药时间顺序，新辅助性Treg耗竭仍然更好。3B
同样，无论是在同一天（图3C）进行新辅助治疗还是辅助抗PD-1或抗PD-1 抗CD137治疗，还是在同一天进行外科手术（图3D），我们仍然 观察到新辅助后长期存活的小鼠比例更大
第四部分 长期生存的新辅助后的肿瘤是被治愈的
接下来，我们进行了一系列实验来确定我的新辅助Treg耗竭小鼠中长期存活的小鼠是否治愈或存在休眠肿瘤。
在这些长期生存的小鼠肺中（肿瘤发生后> 250天）未发现可检测到的gp70水平。
先前我们已经在甲基胆固醇（MCA）诱导的肿瘤休眠模型中证明，平衡期肿瘤可以长期存在于小鼠的体内（数百天），并且受免疫系统的控制（35、36）。在MCA休眠的小鼠体内，CD8 / CD4 T细胞的耗竭和/或IFNγ的中和可以导致肿瘤的快速生长。
为了检验这一点
新队列1：在新辅助DT治疗组中的长期幸存者。
新队列2：另一组队列1与年龄相匹配的FOXP3- DTR小鼠
处理：皮下或皮下注射4T1.2肿瘤
结果：在所有实验中，与对照组相比，这些长期存活者均未发展出逐渐生长的肿瘤或转移灶。
总体而言，我们的数据清楚地表明，新辅助DT治疗的长期幸存者无残留转移性疾病，并已发展出肿瘤特异性记忆免疫反应。
第五部分 新辅助免疫疗法取决于CD8 T细胞和IFNy
接下来，我们研究了小鼠或新辅助抗PD-1 抗CD137治疗的保护作用所涉及的效应因子途径以及免疫参与细胞。
在4T1.2和E0771肿瘤模型中，新辅助疗法的疗效均取决于IFNγ，因为IFNγ被中和后没有长期存活者。
相比之下，穿孔素的损失并没有很大程度地影响新辅助免疫疗法的疗效，因为很大一部分小鼠仍可以长期存活
我们的实验还表明，需要所有三种免疫细胞类型，即CD8，CD4和NK细胞
接下来，我们分析了新辅助免疫疗法与辅助治疗相比诱导更好的抗肿瘤免疫的机制。 考虑到CD8 T细胞在4T1.2和E0771肿瘤模型中都非常重要，我们首先探索了它们的比例是否改变以及在治疗后的血液中是否可以检测到它。
结果：由于我们没有观察到在新辅助和辅助Treg缺失或抗PD-1 / CD137处理组之间CD8 T细胞总数以及比例有任何变化（数据未显示）。
因此我们接下来检测了肿瘤反应性gp70特异性CD8 T细胞的变化
结果：在治疗第10天之前，不同组之间的荷瘤小鼠外周血gp70肿瘤特异性CD8 T细胞水平相似。
令人惊讶的是，在新辅助抗PD-1 抗CD137治疗4天后，我们观察到肿瘤特异性CD8 T细胞大量增加。尽管在第16天切除原发肿瘤后这种情况有所降低，但水平仍然很高，令人惊讶的是，在肿瘤激发后超过170天仍可检测到肿瘤特异性CD8 T细胞。
相反，我们在接受辅助治疗后4天未观察到肿瘤特异性CD8 T细胞的增加幅度相同4D
第六部分 新辅助免疫疗法增加外周血和器官中的肿瘤特异性CD8 T细胞
1、在所有器官中，与辅助抗PD-1 抗CD137治疗组相比，新辅助中肿瘤特异性CD8 T细胞的数量和比例明显更高
2、有趣的是，与切除原发肿瘤的相比，未进行手术的小鼠的器官中通常具有更高水平的gp70肿瘤特异性CD8 T细胞水平，这表明原发性肿瘤可能有助于这些肿瘤特异性T细胞的全身性增加
3、与新辅助免疫治疗和肿瘤切除组相比，非手术组肿瘤特异性T细胞的效应功能较差
4、新辅助的肿瘤特异性CD8 T细胞在肺，血液和肝脏中扮演了效应/记忆表型（CD44 CD62L-）；产生IFNγ和TNF
第七部分 肿瘤特异性CD8 T细胞预测生存的生物标志物
1、新辅助免疫治疗后可长期存活后早期进行测量的小鼠血液中肿瘤特异性CD8 T细胞水平高
2、在接受新辅助Treg清除或抗PD-1 抗CD137的组中，大多数小鼠在第14天或第15天表现出最高水平的肿瘤特异性CD8 T细胞（即，新辅助治疗后的第4天）存活超过100天，并且通常继续成为长期幸存者。
3、在接受新辅助抗PD-1 抗CD137治疗的小鼠中，更清楚地观察到肿瘤特异性CD8 T细胞的大小可作为长期存活的预测因子
4、新辅助免疫疗法诱导的抗肿瘤功效提高可能是由于其能够显着增加肿瘤特异性CD8 T细胞的数量和维持能力，而早期增加是预后的生物标志，尤其是在CD8 T细胞依赖性疗法中
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