膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，在诊断时，25%～30%的膀胱癌患者为肌层浸润性膀胱癌（MIBC）[1]。膀胱根治术是MIBC患者的标准治疗方式，围手术期（新辅助或辅助）的含顺铂化疗可提升部分患者的总生存期[2]。但含铂化疗对患者的身体状况有一定要求，且局部晚期MIBC患者常为高龄，或伴有并发症，无法耐受传统手术。
腔内球囊冷冻消融治疗（Endoscopic Balloon Cryoablation，EBCA）是一种微创治疗，通过内镜将液氮冷冻球囊精确送达病变部位，在可视化的条件下对腔内病灶进行治疗，目前在泌尿系统、消化系统等肿瘤的治疗中均取得一定进展。冷冻消融是一种低温冷冻破坏肿瘤的方式，通过细胞冰化、冷冻、解冻的循环过程造成细胞外液渗透性损伤、小血管阻塞、血栓形成，从而导致细胞凝固性坏死。对于晚期肿瘤患者，尤其是身体条件较差、高龄及不能耐受根治性手术的患者，冷冻消融术耐受性好，可作为这部分患者的治疗选择。此外，冷冻消融能在杀伤肿瘤的同时保持肿瘤的抗原性，这可能与近年热门的免疫治疗形成“协同效应”。
本文通过临床病例和文献资料，阐释冷冻消融联合免疫治疗在泌尿肿瘤中的临床价值。
姜昊文 教授
主任医师 教授 博士生导师
复旦大学泌尿外科研究所 副所长（常务）
复旦大学附属华山医院 泌尿外科副主任
复旦大学附属华山医院 教育处处长、机关三支部书记
中华医学会泌尿外科分会 常务委员
中国性学会泌尿外科专委会 副主任委员
中国抗癌协会泌尿男生殖肿瘤专业委员会 委员
中国临床肿瘤学会前列腺癌专家委员会 委员
中国医师协会泌尿外科医师分会修复重建学组 委员
上海市抗癌协会 理事
上海医学会泌尿外科分会 委员
上海医学会医学教育专委会 委员
获奖或荣誉：
教育部新世纪人才
上海市新百人计划
上海市人才发展基金
上海市医务青年管理十杰
上海市医学科技奖二等奖
复旦大学十大医务青年
上海市新长征突击手
临床特长：
泌尿系统肿瘤的达芬奇和腹腔镜微创手术治疗
冷冻消融技术对尿路上皮癌的保肾和保膀胱的治疗
上尿路结石与狭窄的微创技术与修复重建
案例报道
膀胱直肠瘘是由于肿瘤侵犯、炎症累及、外科手术导致膀胱与直肠相通，常表现为尿瘘（尿液从直肠中流出）和粪瘘（粪便从尿道中排出），严重影响患者生活质量。由于膀胱直肠瘘的瘘管难以定位，其诊断和治疗较为复杂，患者通常需要采用肠道造影、结直肠镜、膀胱镜等方式明确瘘管位置。手术是治疗膀胱直肠瘘最为有效的方式，但成功率较低、术后易复发。
复旦大学附属华山医院泌尿外科姜昊文教授团队和消化内科钟良教授团队强强联合，创新性地采用膀胱镜 肠镜 腹腔镜——“三镜联合”的治疗方式，完成了世界首例腹腔镜、膀胱镜联合肠镜下球囊冷冻消融手术，成功治疗了一例晚期肿瘤引起的复杂的膀胱直肠瘘患者。
患者术前因严重的便血，多次行肠镜治疗，症状时有反复，经本次腔内球囊冷冻消融治疗后症状明显缓解，采用腔内冷冻消融，不仅有效地对肿瘤进行局部治疗，同时成功治疗膀胱直肠瘘，术后患者接受免疫治疗，随访一年余未见复发，患者生活状况有了明显改善。
// 患者基本情况
晚期肿瘤引起的复杂的膀胱直肠瘘
患者男性，85岁，因“间断性便血2年，加重1月”入院。患者2012年因“左侧肾盂占位”行左侧肾 输尿管切除术，2013年因“膀胱占位”行经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBt），病理诊断“浸润性尿路上皮癌”，其后卡介苗灌注并规律随访。2018年6月起出现间断性便血，大便软伴鲜红色血，行肠镜提示：降结肠侧向发育型息肉。于2018年9月行肠镜ESD摘除，术后便血症状未缓解。2019年5月，患者复查肠镜提示：直肠出血，血管性出血可能，予硬化剂注射治疗，术后症状仍有反复。2019年7月，患者复查肠镜提示：距肛门2cm处见3mm×4mm凹陷性瘘管，血痂形成。予凝血酶原喷洒。患者2020年3月再次出现大便带鲜血及尿液，排尿时有排气。盆腔CT提示：盆腔占位性病变，
临床考虑：1.膀胱直肠瘘；2.肿瘤复发转移可能。
图1.术前血便（左）、血尿（右）情况
// 手术及随访
术前多学科讨论
由于患者年纪较大，重度贫血（血红蛋白56g/L）伴血小板减低（血小板71× 109/L），身体状况较差，难以耐受抗肿瘤常规治疗方案，经过华山医院泌尿外科和消化科专家团队的多学科会诊、讨论，决定采用“膀胱镜探查 肠镜下冷冻止血 腹腔镜下盆腔病灶姑息性冷冻治疗”的手术方式。
图2.腹腔镜系统 肠镜 膀胱镜 冷冻球囊示意图
术中照片
图3.膀胱镜联合肠镜术中探查膀胱直肠瘘开口
图4.肠镜联合腹腔镜冷冻消融治疗膀胱直肠瘘及盆腔内肿瘤病灶
术后随访
术后患者症状明显改善，红细胞和血小板均有显著回升，采用辅助化疗联合免疫治疗，至今病灶无明显进展，且无血便、血尿复发。
图5.术后1月（左）及术后1年（右）随访尿液澄清
后续治疗
接受免疫维持治疗，近一年未见复发，定期复查血、尿常规及肝肾功能，贫血明显纠正，肝肾功能较术前均无明显变化。患者近期复查增强CT膀胱、直肠均未见明显异常，未见肾积水、腹水、盆腔积液、盆腔内肿块等疾病复发进展表现。与此同时，患者目前行动自如，精神状态良好，日常生活未受明显影响，生活质量较术前有了明显改善。
冷冻消融治疗的国内临床探索
在国内，一项由复旦大学附属华山医院牵头，由复旦大学附属中山医院、上海交通大学医学院附属瑞金医院、复旦大学附属华东医院、上海交通大学医学院附属第九人民医院、复旦大学附属上海市第五人民医院等多家中心参与的膀胱肿瘤冷冻消融系统（胜杰康生物科技有限公司）研究完成注册临床试验（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02760953）。研究总计纳入200余例患者，试验组行TURBT后在切除部位进行即刻冷冻消融治疗，对照组行TURBT后即刻灌注化疗。经初步的统计分析采用试验组EBCA治疗的临床成功率超过90.9%，高于采用即刻灌注化疗的对照组（76.9%）。同时，多数患者在采用冷冻消融治疗后并发症无明显增加，部分患者术后短期内有尿频、尿急等尿路刺激症状，在对症治疗后得以缓解。经术后6个月随访，试验组的肿瘤复发率为4.5%，对照组的肿瘤复发率为11.4%。中长期的随访结果显示试验组的肿瘤无复发生存率和无进展生存率均优于对照组。本研究验证了冷冻消融治疗浅表性膀胱癌的疗效和安全性。
图6 膀胱肿瘤冷冻消融术（左）和内镜下形成治疗冰球（右）
冷冻消融术:免疫治疗潜在的“绝佳拍档”
冷冻消融的免疫原理
早期观察发现，消融治疗原发肿瘤后，转移灶会出现自发退缩现象。该现象在小鼠模型中得到证实，冷冻消融治疗会诱导机体产生抗肿瘤特异性T细胞应答[3]。在前列腺癌小鼠模型中，冷冻消融导致肿瘤肺转移的减少，同时伴随着全身CD4 、CD8 T细胞和自然杀伤(NK)细胞的增加[4]。此外，临床研究也发现，肾癌患者接受冷冻消融治疗后，抗原提呈细胞(APCs)浸润增多，肿瘤内T细胞抗原识别多样性增加。在切除后的肿瘤组织中，大部分T细胞为消融后新浸润的T细胞，且抗原识别一致的T细胞在外周血中频率同时增加，提示冷冻消融诱导了系统性免疫反应[5]。
因此，冷冻消融在制造局部肿瘤杀伤的同时，也引起全身性的抗肿瘤特异性免疫反应。这为其联合免疫治疗实现更为强大和持久的抗肿瘤免疫反应提供了机会[6]。
通过文献查询，我们列举了冷冻消融联合免疫治疗的机制优势：
（一）“坏死”非“凋亡”，保留抗原性：
冷冻消融对免疫调节的机制主要取决于细胞的死亡机制[7]。主要表现为肿瘤中心区的坏死和周围带的凋亡,一般认为坏死可促进细胞内容物的释放,而这些因子通常具有刺激机体产生免疫反应的作用。从坏死细胞中释放出来的抗原，被树突状细胞（DC）等抗原呈递细胞摄取后，诱导共刺激信号，从而产生抗肿瘤T细胞反应。相比之下，在亚致死温度下，消融区周围的细胞会通过线粒体介导的凋亡途径死亡，此途径往往会诱导周围免疫耐受[8]。免疫原性坏死和免疫耐受性凋亡之间的平衡取决于冷冻消融局部的情况(图6)[9]。动态流程如下：1）解冻后，机械损伤的细胞坏死死亡，释放其内容物到周围环境；2）经历渗透冲击的细胞会膨胀和破裂；3）暴露于亚致死温度的消融区边缘细胞则发生凋亡；4）从坏死细胞中释放出来的抗原，被树突状细胞等抗原呈递细胞摄取后，诱导共刺激信号，从而产生抗肿瘤T细胞反应。
图7.冷冻消融中细胞死亡的模式[9]
（二）冷冻消融重塑免疫微环境：肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存和发展的基础，微环境中所形成的组织缺氧、细胞外基质、生长因子和蛋白水解酶、血管新生及免疫炎性反应等为肿瘤细胞的生长提供了“土壤”[10]。肿瘤中含有大量的免疫抑制细胞，冷冻消融在杀死肿瘤细胞的同时，清除了肿瘤中的免疫抑制性DC和诱导耐受的免疫细胞。消融后的局部炎性环境又从血液中招募新生力量，诱导形成 “有功能”的DC，新生的DC桥接固有和适应性免疫，进而恢复“肿瘤免疫循环”（图7）[11]。
图8. 冷冻消融重塑肿瘤免疫微环境的示意图[11]
（三）冷冻消融术联合免疫治疗增加TCR多样性：以PD-1/PD-L1为靶点的免疫检查点抑制剂，其主要机制为释放预存于机体中的抗肿瘤免疫应答。与冷冻消融术的组合会对免疫应答产生哪些影响呢？Page等通过T细胞受体（TCR）DNA测序评估冷冻消融联合免疫治疗对免疫应答的影响[12]。该研究纳入18例早期乳腺癌患者，分为三组，分别接受冷冻消融、伊匹木单抗单药治疗或冷冻消融联合伊匹木单抗治疗。研究结果显示，伊匹木单抗单药仅增加了肿瘤内T细胞密度，而接受冷冻消融治疗则会增加瘤内T细胞TCR的多样性，并重塑瘤内T细胞TCR克隆库。与单药治疗相比，冷冻消融联合伊匹木单抗治疗后的患者外周血和肿瘤内T细胞的数量和多样性均有提升。因此，冷冻消融联合免疫治疗不仅可以激活预存的免疫应答，还可以诱导针对新生抗原的应答，而这可能是提升肿瘤免疫治疗缓解率的基础。
近年来，以PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗快速发展，改写了多种恶性肿瘤的临床实践，消融技术联合免疫治疗是进一步提升免疫治疗有效率的方式之一。目前国际上已有多个正在开展的冷冻消融联合免疫检查点抑制剂的相关临床试验。
表1.冷冻消融联合免疫检查点抑制剂的相关临床试验[9]
专家点评
在癌症治疗中，经皮消融技术被广泛应用于治疗和局部控制多种类型的恶性肿瘤。肿瘤组织的冷冻消融导致的细胞坏死，与热消融不同，低温消融通过渗透压差和坏死途径导致肿瘤细胞死亡。此种情况下，癌细胞的细胞内内容物保持完整，可以诱导产生抗原特异性的免疫反应。免疫反应是系统性的，消融诱导的特异性反应也将影响消融组织外的癌细胞，即所谓的“远隔效应”。遗憾的是，这种效应在单纯使用冷冻消融时鲜有被观察到，但当冷冻消融与免疫治疗结合时，两种疗法相互促进，免疫应答可能进一步增强，两者之间相互协同，既有助于消除消融术后残留的肿瘤组织，又可降低肿瘤的复发率和转移率。从文献回顾中可以看到，冷冻消融导致的肿瘤坏死可在抗原和免疫微环境两方面促进抗肿瘤应答的产生。在临床中，冷冻消融联合免疫治疗可用于传统方案无法治愈患者的治疗，有着独特的优势。我们中心正在开展多项腔内冷冻消融联合辅助免疫治疗的前期研究，随着前瞻性临床试验的开展，该方案将拥有更多的循证医学证据，或将成为泌尿肿瘤治疗的又一利器。
参考文献：
1.Burger, M., et al., Epidemiology and risk factors of urothelial bladder cancer. Eur Urol, 2013. 63(2): p. 234-41.
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4.Yang, X., et al., Cryoablation inhibition of distant untreated tumors (abscopal effect) is immune mediated. Oncotarget, 2019. 10(41): p. 4180-4191.
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7.Hoffmann, N.E. and J.C. Bischof, The cryobiology of cryosurgical injury. Urology, 2002. 60(2 Suppl 1): p. 40-9.
8.Maccini, M., et al., Biophysiologic considerations in cryoablation: a practical mechanistic molecular review. Int Braz J Urol, 2011. 37(6): p. 693-6.
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10.Galon, J. and D. Bruni, Approaches to treat immune hot, altered and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(3): p. 197-218.
11.Giovanelli, P., T.A. Sandoval, and J.R. Cubillos-Ruiz, Dendritic Cell Metabolism and Function in Tumors. Trends Immunol, 2019. 40(8): p. 699-718.
12.Page, D.B., et al., Deep Sequencing of T-cell Receptor DNA as a Biomarker of Clonally Expanded TILs in Breast Cancer after Immunotherapy. Cancer Immunol Res, 2016. 4(10): p. 835-844.
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