RBMS1 通过 SLC7A11 的翻译控制调节肺癌铁死亡

摘要

铁死亡是一种铁依赖性非凋亡细胞死亡，是一种高度调节的肿瘤抑制过程。然而，RNA结合蛋白在肺癌进展过程中调控铁死亡逃逸的功能和机制仍然未知。在这里，我们报道了RNA 结合蛋白 RBMS1 通过介导铁死亡逃避参与肺癌的发展。通过 shRNA 介导的系统筛选，我们发现 RBMS1 是一个关键的铁死亡调节剂。临床上，RBMS1 在肺癌中升高，其高表达与患者存活率降低有关。相反，RBMS1 的消耗抑制了体内和体外肺癌的进展。从机制上讲，RBMS1 直接与翻译起始因子 eIF3d 相互作用以桥接 SLC7A11 的 3¢-和5¢-UTR。RBMS1 消融抑制 SLC7A11 的翻译，减少 SLC7A11 介导的胱氨酸摄取并促进铁死亡。在针对 RBMS1 的药物筛选中，我们进一步发现盐酸去甲替林降低了 RBMS1 的水平，从而促进了铁死亡。重要的是，RBMS1 耗竭或盐酸去甲替林的抑制使抗辐射肺癌细胞对放疗敏感。我们的研究结果将 RBMS1 确立为铁死亡的转化调节因子和具有治疗潜力和临床价值的预后因素。

结果

系统鉴定 RBMS1 作为肺癌铁死亡的关键调节因子

研究人员通过RBP 的 shRNA 文库进行了 RNAi 筛选，最终确定RNA 结合蛋白 RBMS1是对铁死亡有重大影响的最高命中（图 1B）。如图 1C 所示，RBMS1 缺失的A549 肺癌细胞对erastin 诱导的铁死亡极其敏感，而这种敏感性被铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 (Ferr-1) 阻止，表明RBMS1 的消耗促进了肺癌细胞中的铁死亡。随后，研究人员用两个独立的 shRNA 构建了 RBMS1 稳定消耗的 H1299 肺癌细胞，并发现 RBMS1 的敲低显着提高了erastin 触发的脂质过氧化（图1D )。透射电子显微镜 (TEM) 和结构化照明显微镜 (SIM)分析都进一步显示，RBMS1 耗尽的肺癌细胞具有铁死亡的典型形态特征（图 1E，图 1F）。

图1

功能上，RBMS1 的减少显着促进了erastin 诱导的细胞死亡（图2A）。研究人员用叔丁基过氧化氢（TBH）诱导铁死亡，结果显示 H1299 细胞中 RBMS1 的缺失显着增加了细胞死亡，这也可以被铁死亡抑制剂 Ferr-1 抑制，但不能被细胞凋亡抑制剂 Z-VAD-fmk 或自噬抑制剂 3-MA 抑制，这进一步证实 RBMS1 缺乏使肺癌细胞对铁死亡敏感且与细胞凋亡和自噬无关。随后 RBMS1 重新在 H1299 细胞中表达，RBMS1 消耗稳定，显着逆转了埃拉汀诱导的铁死亡，并显着减少了细胞死亡（图 2H-2I）。综上所述，表明 RBMS1 的缺失会刺激肺癌细胞中的铁死亡。

图2

RBMS1 与人和小鼠的肺癌进展和预后相关

研究人员使用包含肺癌组织 (n = 60) 和匹配的相邻肺组织 (n = 60) 的组织微阵列 (TMA) 的连续切片，通过免疫组织化学 (IHC) 染色检查了 RBMS1 的表达（图 3A）。其中超过 50% 的肺癌样本对 RBMS1 表现出强染色或超强染色，而只有不到 5% 的相邻肺组织对 RBMS1 表现出强染色或超强染色（图 3B）。此外，RBMS1 表达水平较高的肺癌患者通常具有较高的临床分期肿瘤，表明 RBMS1 的表达水平与肺癌患者的临床分期呈正相关。因此，临床观察表明 RBMS1 是肺癌的潜在预后因素。研究人员又对小鼠进行的检测也与对临床样本的观察一致，这支持了 RBMS1 的缺失显着抑制肺癌进展的观点，并且这种抑制与铁死亡标志物 (4HNE) 染色增加有关。综上所述，RBMS1 与人和小鼠的肺癌进展和预后相关。

图3

RBMS1 的缺失抑制了培养细胞中肺癌的进展

研究人员通过检查了一组肺癌细胞系中的 RBMS1 水平，发现RBMS1 在多种肺癌细胞系中显着增加（图 4A）且RBMS1的消耗显着抑制H1299和A549肺癌细胞的细胞生长（图4B）。随后他们通过体内和体外RBMS1 水平对肺癌细胞的影响发现RBMS1 耗尽的 H1299 细胞的生长速度比对照慢得多，并且与对照细胞相比，肿瘤更小（图 5F-5H）。因此，RBMS1 的缺失抑制了培养细胞和异种移植肿瘤中肺癌的进展。

图4

图5

RBMS1 的消耗抑制了肺癌的进展有一部分是通过减少 SLC7A11 以及随后激活铁死亡实现的

研究人员使用多西环素诱导的 RBMS1 耗竭或过度表达的肺癌细胞进行了定量蛋白质组学分析，发现SLC7A11（铁死亡的关键抑制因子）的蛋白质水平在 RBMS1 耗尽后显着降低，而RBMS1 的稳定过表达提高了 SLC7A11 的表达水平，但没有提高其他铁死亡调节因子的表达水平（图 5B ）。由于 SLC7A11 调节细胞外胱氨酸（谷胱甘肽生物合成的主要前体）的摄取，研究人员随后检查了胱氨酸摄取，发现在 RBMS1 敲低或 RBMS1 缺失的H1299 肺癌细胞中恢复 SLC7A11 几乎完全抑制了erastin触发的细胞死亡，以及抑制了由低胱氨酸培养基引发的脂质过氧化（图 6A ）并逆转了低胱氨酸培养基诱导的细胞死亡（图 6B 和 6C），这表明这种作用依赖于SLC7A11 对胱氨酸的摄取。总之，数据表明 RBMS1 耗竭主要通过抑制 SLC7A11 表达促进铁死亡，并进一步表明 RBMS1 的减少可能至少部分通过抑制 SLC7A11 和促进铁死亡来抑制肺癌进展。研究人员发现在 RBMS1 稳定消耗的肺癌细胞中恢复 SLC7A11 的表达可以部分恢复RBMS1 敲低诱导的细胞生长抑制（图 6D）。此外，根据集落形成试验和 EdU 染色判断，SLC7A11 重新表达显着促进了 RBMS1 耗尽的肺癌细胞的增殖能力。综上所述，RBMS1 的缺失抑制肺癌进展有一部分是通过抑制 SLC7A11 和促进体外和体内铁死亡来实现的。

图6

RBMS1 调节 SLC7A11 的翻译

研究人员通过研究发现SLC7A11 的 mRNA 水平不受RBMS1 的影响，这表明 RBMS1 可能在 RNA 后水平调节 SLC7A11 的表达，包括翻译。他们使用来自 SLC7A11 的不同启动子和 UTR 片段生成了四个翻译报告基因 （图 7B）进行了荧光素酶报告基因检测，发现肺癌细胞中耗尽的 RBMS1 显着抑制了荧光素酶报告基因 SLC7A11-fluc-FL 的活性，然而，SLC7A11-fluc-FL 的 mRNA 水平不受影响（图 7C）。此外，荧光素酶只报告基因 SLC7A11-fluc-T3 的活性，在 RBMS1 耗尽的肺癌细胞中被显着抑制（图 7D ），表明 RBMS1 调节 SLC7A11 蛋白是通过其 3¢-UTR 的后半部分进行翻译的。综上所述，RBMS1 能够通过其 3¢-UTR 的下游区域促进 SLC7A11 的翻译。

图7

RBMS1 与 eIF3d 相互作用以桥接 SLC7A11的 3¢-和 5¢-UTR 以促进其翻译

研究人员在使用基因本体分析潜在 RBMS1 相互作用蛋白的细胞功能时，发现相互作用蛋白主要富含多种翻译相关途径，包括翻译调节、翻译起始和核糖核蛋白生物发生（图 9A）。在免疫沉淀 (IP) 偶联质谱分析中，他们使用外源表达的 RBMS1 作为诱饵，鉴定了多个关键翻译调节因子，包括帽结合蛋白真核起始因子 3d(eIF3d)、eIF3i 和 eIF3m，这些因素是 eIF3 复合体的关键组成部分，可以驱动翻译起始的帽依赖性途径。研究证实了外源表达的eIF3d、eIF3i 和 eIF3m 可以在 co-IP 检测中分别拉低内源性 RBMS1（图 9C），而且外源表达的 RBMS1 也可以分别拉低了 H1299 和 A549 细胞中的内源性 eIF3d、eIF3i 和 eIF3m。随后的连接分析 (PLA) 证实 RBMS1 确实与细胞质中的内源性 eIF3d 相互作用（图 9G)。这些数据表明 RBMS1 可能通过与 eIF3d 直接相互作用来调节 SLC7A11 的翻译。随后的研究数据表明 eIF3d 通过 RBMS1 与 SLC7A11 的3¢-UTR 相关，而 RBMS1 通过 eIF3d 与 SLC7A11 的 5¢-UTR 结合。综上所述，作者的结果支持一个模型，其中 RBMS1 与 eIF3d 复合物结合以桥接 SLC7A11 的 3¢-和5¢-UTR，进而促进 SLC7A11 的翻译（图 10I）

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图10

RBMS1 与临床样本中升高的 SLC7A11 呈正相关，并赋予肺癌细胞对放疗的抵抗力

研究人员通过检查RBMS1 和 SLC7A11 在7名患者的配对 NSCLC 样本和邻近正常组织中的表达发现，与匹配的邻近正常组织相比，所有 NSCLC标本的 RBMS1 和 SLC7A11 蛋白水平显着增加（图 11A），并且临床样本中 SLC7A11 的水平与 RBMS1 的水平呈正相关。此外，SLC7A11 水平相对较高的肺癌患者的总生存期短于 SLC7A11 水平较低的肺癌患者（图 11E）。因此，临床观察表明，肺癌患者样本中RBMS1与SLC7A11呈正相关，进一步证明RBMS1在肺癌中的临床价值是通过调节铁死亡。IR 抗性 A549 细胞中 RBMS1 的敲低降低了 SLC7A11 的水平（图 12B），诱导了更多的脂质过氧化（图 12C），并使这些细胞对辐射显着敏感（图 12D）。综上所述，RBMS1 与临床样本中升高的 SLC7A11 呈正相关，并使肺癌细胞对放疗产生抗性。

图11

图12

盐酸去甲替林通过促进铁死亡抑制 RBMS1 表达并使抗 IR 肺癌细胞对辐射敏感

研究人员通过实验验证了 NTP 降低了 RBMS1  在 IR 抗性 A549 肺癌细胞中的表达水平并显着抑制了肺癌细胞中荧光素酶报告基因SLC7A11-fluc-T3 的活性（图 12H）来降低SLC7A11 的水平（图 12I）而不影响其他铁死亡相关因子的表达。此外，NTP 显着促进了erastin 诱导的细胞死亡，这可以被铁死亡抑制剂Fer-1 拯救，表明NTP 的治疗也可以刺激铁死亡（图12J ）。因此，与用载体处理的那些细胞相比，NTP 处理使抗 IR 肺癌细胞对辐射敏感（图 12K）。综上所述，NTP 抑制 RBMS1 可使抗 IR 肺癌细胞对放疗敏感，通过促进铁死亡为肺癌患者提供一种新型有效的治疗剂。