研究背景：
脓毒症期间肺部特别容易受到损伤，超过50%的患者发生急性肺损伤（ALI）的主要危险因素归因于脓毒症。铁死亡在脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）中起着关键作用。衣康酸（Itaconate）是炎症性巨噬细胞激活过程中产生的代谢物，参与免疫调节、氧化应激和脂质过氧化。然而，衣康酸与铁死亡之间的关系尚不清楚。
研究结果：
1.衣康酸缓解脓毒症诱导的ALI和肺巨噬细胞浸润。
4-辛基衣康酸盐（4-OI）是内源性衣康酸盐的细胞通透性衍生物。体内实验中，小鼠注射LPS (10 mg/kg) 12 h以建立实验性脓毒症模型。作者首先研究了4-OI在ALI模型小鼠中的功能。HE染色结果表明，与LPS组相比，4-OI预处理显著减轻LPS诱导的ALI（表现为肺出血、间质水肿、肺泡壁增厚和组织损伤）。Masson染色结果显示衣康酸降低了LPS诱导的肺间质纤维化水平。4-OI预处理降低了肺损伤评分、缓解了LPS导致的肺湿/干重比的增加趋势、降低了肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白质（经ELISA试剂盒检测）和mRNA水平。此外，肺组织中CD68（巨噬细胞标记物）和DAPI免疫荧光染色图像显示，衣康酸可显著减少LPS诱导的巨噬细胞浸润。综上所述，衣康酸可以显著减轻脓毒症诱导的小鼠ALI和巨噬细胞浸润。
图1
2.衣康酸抑制脓毒症诱导的ALI小鼠的铁死亡
接下来探究衣康酸在ALI铁死亡中的作用。作者通过对以前研究中的巨噬细胞RNA序列数据进行差异基因表达分析发现，衣康酸预处理后，铁死亡相关基因发生显著变化。检测发现，LPS处理使肺组织中GPX4和PTGS2的的蛋白质和mRNA表达降低，而4-OI预处理可逆转这种变化。此外，4-OI降低LPS诱导的组织铁水平升高。MDA水平和4-HNE的免疫组化结果证实LPS可促进肺脂质过氧化，但4-OI可显著抑制。综上所述，衣康酸显著抑制小鼠脓毒症诱导的ALI铁死亡。
图2
3.衣康酸通过增加和激活脓毒症诱导的ALI中的Nrf2来抑制铁死亡
作者发现4-OI提高了Nrf2蛋白水平，但不影响其mRNA水平。此外，4-OI逆转了LPS诱导的Nrf2减少，并增加了已识别的下游靶基因HO-1的表达；显著提高SLC7A11和GCLM水平，并逆转LPS诱导的其降低；增加LPS刺激后体内GSH水平和GSH/GSSG比率。免疫荧光染色显示，4-OI显著抑制LPS诱导的ROS增加。综上所述，衣康酸通过增加和激活小鼠的Nrf2来抑制铁死亡。
图3
3.衣康酸增加Nrf2水平以抑制LPS诱导的THP-1细胞的铁死亡
接下来，作者在THP-1细胞上进行了体外实验，以评估LPS诱导的ALI与铁死亡之间的关系。LPS刺激后0h、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h测定GPX4蛋白水平，1 h后GPX4蛋白水平急剧上升，然后持续下降，直到24 h。作者还发现，4-OI和Fer-1预处理均能显著增加Nrf2、GPX4、SLC7A11C和GCLM的表达（0.25% mM时表现出更强的康铁死亡性），并增加GSH和GSH/GSSG比率。下面，作者构建了针对Nrf2的siRNA，并成功降低了THP-1细胞中的Nrf2水平，以进一步证实4-OI的铁死亡抗性依赖于Nrf2。结果表明，Nrf2沉默后，GPX4水平显著降低，4-OI的保护几乎完全消失；GCLM、SLC7A11和HO-1的蛋白质和mRNA水平持续下降，并且不能被4-OI保留。综上所述，衣康酸的抗铁死亡性依赖于Nrf2，并且在Nrf2沉默后几乎完全消失。
图4
3.在Nrf2-KO小鼠中，4-OI对ALI小鼠铁死亡的变化作用被取消
接下来作者进一步验证4-OI对铁死亡的抑制作用是以Nrf2依赖的方式进行的，使用Nrf2基因敲除小鼠构建ALI模型并发现，发现Nrf2的缺失加重了脓毒症诱导的ALI。此外，在4-OI预处理的Nrf2-/-小鼠中，与WT组相比，肺组织内4-HNE和ROS水平没有显著减弱，GSH、GSH/GSSG比值和MDA水平没有缓解趋势。但4-OI仍然可以降低Nrf2-/-小鼠中LPS诱导的组织铁水平升高，表明4-OI也可能通过Nrf2非依赖机制调节细胞质铁。综上所述，可以确定，衣康酸通过阻断Nrf2降解抑制巨噬细胞的铁死亡，并对脓毒症诱导的ALI有保护作用。
图5
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研究总结：
在本研究中，作者首次证明衣康酸可以通过抑制巨噬细胞的铁死亡来缓解脓毒症诱导的ALI。在机制上，作者发现内源性衣康酸4-OI的衍生物可以抑制GPX4依赖的脂质过氧化；4-OI抑制巨噬细胞铁死亡的功能依赖于阻断Nrf2的降解，Nrf2的增加促进了靶基因的转录，包括GPX4、GCLM、SLC7A11；在LPS诱导的ALI中，4-OI预处理后，肺中的促炎症因子，包括IL-1β、IL-6和TNF-α减少。基于以上结果，作者认为衣康酸可能是LPS诱导的ALI铁死亡的抑制剂。KEAP1是一种细胞质蛋白，可与Nrf2形成复合物，并通过泛素化降解Nrf2。本研究显示，衣康酸增加了Nrf2的蛋白质水平，但对其mRNA水平没有影响，这表明Nrf2降解的减少是由于Keap1的烷基化。另外，作者提出本研究也存在局限性：（1）外源性衣康酸衍生物与内源性衣康酸之间是否存在差异，如调节机制和靶点；（2）现已证明了4-OI通过抑制脂质过氧化来抑制铁死亡，衣康酸与磷脂底物或铁代谢之间的关系仍需进一步探讨。
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