研究背景
结直肠癌（CRC）患者的一线治疗是治愈性手术。手术后，III期和IV期结肠癌患者可接受包括5氟尿嘧啶（5FU）和奥沙利铂的辅助化疗。脂联素2（LCN2）是一种分泌型糖蛋白，可维持胃肠粘膜的完整性。LCN2与细菌和人类的苷酸形成复合物，从而抑制细菌生长并调节铁平衡。LCN2的过度表达导致结肠癌异种移植模型中肿瘤形成的增加。作者之前研究证明，LCN2是结肠癌细胞系HCT116中plakophilin3（PKP3）缺失后观察到的增加侵袭和肿瘤进展所必需的。
研究结果
1.LCN2水平在结肠癌中增加，导致对5FU的抗性增加
首先，作者通过定量逆转录酶偶联PCR（qRT-PCR）和Western blot分析，分别测量了在Tata Memorial Centre（TMC）收集的80份匹配的正常和结肠癌样本的LCN2 mRNA和蛋白水平。结果发现，与相邻的形态正常的组织相比，肿瘤组织中的LCN2 mRNA和蛋白水平大幅提高。同样，LCN2的mRNA表达在TCGA结肠腺癌（COAD）数据集中也是升高的。这些实验结果表明，LCN2的表达在结肠肿瘤样本中是升高的。
结肠癌细胞系HCT116中PKP3的缺失导致分泌的LCN2表达增加，这是肿瘤进展所必需的。因此，作者在HCT116细胞中产生了LCN2过度表达系。作者发现，在HCT116细胞中过量表达LCN2导致软琼脂中的菌落形成增加，并在免疫力低下的小鼠中形成肿瘤。同时，作者通过对不同结肠癌系的分析，发现LCN2表达的增加与软琼脂试验中菌落数量的增加相关。
接下来，作者通过克隆生成的生存试验表明，PKP3(是位于11号染色体的基因)的丢失导致对5FU的抗性增加。作者还观察到的耐药性依赖于LCN2的表达，因为双敲除的克隆显示出对5FU的敏感性增加。当用5FU处理LCN2过度表达的克隆时，作者也观察到类似的结果。同样，作者在测试不同的结肠癌细胞系中，发现对5FU的抗性增加与LCN2水平的增加相关。为了确定是否在体内观察到耐药性的增加，作者将载体对照或PKP3敲除克隆注射到免疫力低下的小鼠体内，当肿瘤达到特定大小时用5FU治疗。实验结果显示，矢量对照组对5FU的治疗有反应，肿瘤大小减少，而PKP3敲除克隆的大小继续增长。这些结果表明，LCN2对5FU的抗性既是必要的也是充分的。
图1
2.LCN2的表达导致了ROS的清除
接下来，作者对细胞未经处理或用5FU处理，并在处理后用两种不同的方法测量ROS清除。实验结果显示，虽然所有的细胞在处理后3小时都有类似的ROS水平，但PKP3敲除的克隆在处理后24小时的ROS清除率都比载体对照组高。相比之下，PKP3 LCN2双敲除的克隆在处理后24小时不能清除ROS。同样，作者发现，在LCN2过表达的克隆和不同的结肠癌细胞系中，LCN2水平的增加与ROS的清除相关联。
LCN2在儿茶酚存在下与Fe3 结合，阻止Fe3 转化为Fe2 ，从而打破了ROS生成的循环，导致ROS的清除。作者发现，与载体对照或PKP3 LCN2双敲除细胞相比，PKP3敲除细胞在5FU处理后的总铁含量减少。有趣的是，实验结果显示，即使在没有任何处理的情况下，双敲除细胞的细胞内铁含量也较高。作者还发现未经处理的细胞中的大部分铁是以铁的形式存在，而在用5FU处理后，铁的形式更加丰富。随后，作者发现，用5FU处理后，HCT116衍生的LCN2过表达细胞以及HT29（结肠癌细胞）和DLD1（结直肠腺癌上皮细胞）细胞中的亚铁水平比HCT116低得多，这一结果与在这些细胞系中观察到的LCN2水平差异是一致的。而且，作者实验结果表明，用铁螯合剂DFO处理PKP3 LCN2双敲除的克隆，在用5FU处理时，细胞存活率增加。
为了确定LCN2结合儿茶酚铁复合物的能力是否是耐受5FU的必要条件，作者在用5FU处理之前，将PKP3 LCN2双敲除的细胞与重组形式的HoloLCN2（与铁结合）、ApoLCN2（不与铁结合）以及不能与儿茶酚铁复合物结合的LCN2突变体（K125AK134A）进行孵化。随后，用重组的Holo和Apo LCN2蛋白处理后，作者发现双倍敲除的克隆的存活率增加。相反，K125AK134A突变体不能赋予对5FU的抗性。这些结果表明，LCN2结合铁-儿茶酚复合物的能力是刺激清除ROS的必要条件。
为了确定LCN2结合儿茶酚铁复合物的能力是否是耐受5FU的必要条件，作者在用5FU处理之前，将PKP3 LCN2双敲除的细胞与重组形式的HoloLCN2（与铁结合）、ApoLCN2（不与铁结合）以及不能与儿茶酚铁复合物结合的LCN2突变体（K125AK134A）进行孵化。随后，用重组的Holo和Apo LCN2蛋白处理后，作者发现双倍敲除的克隆的存活率增加。相反，K125AK134A突变体不能赋予对5FU的抗性。这些结果表明，LCN2结合铁-儿茶酚复合物的能力是刺激清除ROS的必要条件。
图2
3.LCN2通过促进xCT和GPX4的表达来抑制铁死亡
上述结果表明，LCN2表达的增加导致了细胞内亚铁水平的下降。此外，作者发现LCN2的表达水平与5FU处理后过氧化脂质的清除率增加相关。相反，PKP3敲除克隆中LCN2的敲除损害了过氧化脂质的清除。随后，作者使用重组WT LCN2处理PKP3 LCN2双敲除克隆，导致脂质ROS的清除增加。相反，作者发现，用K125AK134A突变体处理并没有恢复清除过氧化脂质的能力，这表明LCN2刺激清除过氧化脂质的能力取决于其结合铁-儿茶酚复合物的能力。这些结果表明，LCN2对脂质ROS的清除取决于LCN2调节铁平衡的能力。
过氧化脂质的增加是由于GPX4水平的下降或由于system xc-的抑制导致细胞内GSH水平的降低。作者实验结果表明，在所有的细胞系中，LCN2的水平与GSH的水平增加相关。而且，作者发现在PKP3敲除的克隆中，抑制LCN2的表达导致GSH水平下降。为了确定GSH水平的提高是否是由于GPX4或system xc-水平的提高，作者实验证明了system xc-的运输亚单位xCT（基因名SLC7A11）或GPX4的蛋白质和mRNA水平在LCN2水平高的细胞中更高，特别是在用5FU处理后。此外，作者发现，虽然所有的细胞系在用5FU处理后xCT和GPX4的水平都增加了，但在表达较高水平的LCN2的细胞系中，这种增加更为明显。相反，PKP3敲除细胞中LCN2的敲除导致5FU处理时xCT水平下降。随后，作者使用铁死亡诱导剂erastin和RSL3处理，结果发现LCN2含量高的细胞系的存活率下降。这些结果表明，LCN2表达的增加导致了5FU诱导的铁死亡抑制，这是由于细胞内铁水平的改变和system xc-活性的增加。
图3
4.xCT或ETS1的缺失导致表达LCN2的细胞治疗耐药性的逆转
接下来，作者在LCN2水平较高的细胞中使用载体驱动的RNAi（RNA干扰）抑制xCT的表达；产生HCT116衍生的PKP3敲除克隆和结肠癌细胞系HT29和DLD1，并且产生了敲除xCT的稳定系。作者发现，xCT的缺失导致用5FU处理时总ROS和过氧化脂质水平的增加。作者还发现，xCT敲除还导致在有5FU和没有5FU的情况下存活率的下降，以及软琼脂中菌落形成的减少。这些结果表明，LCN2表达的增加导致了5FU诱导的铁死亡抑制，这是由于细胞内铁水平的改变和system xc-活性的增加。
接下来，作者发现，在5FU存在或不存在的情况下，LCN2的表达导致了所有测试的细胞系中ETS1（癌基因）蛋白水平的增加。同样，作者发现在PKP3 KD细胞中LCN2的缺失导致ETS1水平下降。作者还通过染色质免疫沉淀（ChIP）检测和实时PCR显示，在LCN2水平升高的细胞系中，ETS1在xCT启动子上的占用率高于各自的载体对照，尤其是在用5FU处理时。
为了进一步证实这些结果，作者在PKP3敲除的克隆和HT29细胞中瞬时抑制了ETS1的表达。实验结果表明，这两种细胞的LCN2水平都很高，ETS1敲除的克隆中xCT和GPX4水平下降。作者还用5FU处理这些细胞，导致存活率下降，ETS1敲除后LCN2表达也下降，表明这两个基因之间存在正反馈回路。随后，作者通过CHIP检测显示，在5FU存在的情况下，ETS1对LCN2启动子的占用增加，而在没有5FU的情况下，占用增加较小，但不明显。这些结果表明，LCN2刺激转录因子ETS1的增加，可以导致xCT的表达增加。
图4
5.抑制LCN2功能导致体外和体内对5FU的敏感性
接下来，作者产生了一种特异性的LCN2单克隆抗体（3D12B2）。首先，作者在加入5FU的IC50值之前，将不同的结肠癌品系与载体对照、mIgG或3D12B2培养12小时，然后进行生存率测定。实验结果显示，用抗体处理，而不是用mIgG或载体对照，导致对5FU处理的存活率显著下降。同样，在HCT116衍生的PKP3敲除细胞中也得到了类似的结果。随后，作者用3D12B2而不是对照抗体处理，结果显示xCT和GPX4的水平下降，过氧化脂质的清除率下降。作者还发现用3D12B2治疗可以使细胞内亚铁水平的增加，特别是与用5FU治疗时与载体对照相比。此外，作者发现与用mIgG处理相比，用3D12B2处理导致所有细胞在软琼脂中的集落形成减少。
然后，作者给裸体小鼠注射PKP3敲除克隆或DLD1细胞系。一旦肿瘤长到适当的大小，就按所述方法进行未处理或用5-FU处理。除5-FU处理外，作者还向裸鼠注射载体对照、非特异性mIgG或3D12B2，并监测肿瘤体积。实验结果显示，在有或没有5FU的情况下，注射PKP3敲除克隆或DLD1细胞的小鼠有效形成肿瘤。同时，用非特异性的mIgG处理并不影响肿瘤的形成。相反，在PKP3敲除的克隆中，用3D12B2处理抑制了肿瘤的发展，并与5FU联合诱导肿瘤消退。作者还发现，用3D12B2处理导致注射了DLD1细胞的小鼠的肿瘤生长明显减少，在有5FU的情况下，肿瘤生长进一步减少。这些结果表明，3D12B2可能是一种潜在的肿瘤治疗分子。上述结果表明，LCN2通过调节细胞内铁水平和促进ETS1的表达来抑制铁死亡作用，从而导致xCT和GPX4的水平增加。
图5
接下来，作者通过qRT-PCR和Western blot分析表明，与邻近的正常组织相比，结肠肿瘤样本中的xCT水平升高了。而且在分析研究中使用的肿瘤样本时，作者观察到LCN2和xCT的mRNA水平之间存在正相关关系。随后，作者通过对TCGA的COAD队列的类似分析表明，与正常组织相比，肿瘤样本中的xCT水平明显增加。而且，在TCGA队列中观察到LCN2和xCT的mRNA水平之间也存在正相关。此外，作者通过对用5FU治疗的免疫力低下的小鼠的肿瘤异种移植的xCT水平的分析，发现PKP3敲除克隆形成的肿瘤中xCT的表达比载体对照的增加。同样，与邻近的正常对照组相比，结肠肿瘤样本中ETS1 mRNA水平也明显增加，并且也与xCT水平呈正相关。这些结果表明，我们的细胞系数据所显示的化疗耐药性增加的基本途径代表了人类肿瘤样本中可能发生的情况。
图6
研究结论
综上所述，脂联素2是一个治疗结直肠癌的潜在治疗靶点。脂联素2可通过降低细胞内铁水平和刺激谷胱甘肽过氧化物酶4和半胱氨酸谷氨酸逆向转运蛋白xCT的表达来抑制铁死亡，促进肿瘤的发展和治疗的抗性。而且，作者研究中描述的单克隆抗体可以作为对化疗没有反应的患者的潜在治疗基础。
