背景
肝细胞癌（HCC）为消化道肿瘤中恶性程度较高的肿瘤，预后与患者选择的手术方式，以及后期治疗密切相关。肝细胞癌一般为原发癌或者其他癌症如大肠癌、结肠癌转移所导致的癌症。因为肝脏为双重血液供应，包括门静脉供血与动脉供血，所以肝细胞癌的恶性程度较高、转移较快、转移时间较早、预后较差。而索拉非尼是HCC的一线化疗药物，又因为HCC细胞的多药耐药（MDR）使索拉非尼对HCC的治疗效果并不乐观，而逆转MDA的药物毒副作用很大。作为一种重要的膜转运体，ATP结合盒（ABC）家族可以与许多膜转运体合作，在运输物质方面发挥积极作用。ABC家族成员与其他膜转运体合作，运输细胞内和细胞外的营养物质或毒素，家族内的分子间协同作用也很显著，而ABC介导的药物外流被认为是MDR的主要机制，因此癌细胞中ABC转运体的过度表达与抗癌药物的外流增加有关，这可以诱发肿瘤的耐药性。而ABC转运蛋白家族中的ABCC4和ABCC5主要对嘌呤和核苷酸模拟物耐药，同时ABCC5/MRP5是一种通用的谷氨酸缀合物，影响内源性代谢物、毒素、药物和细胞内离子的外排，引起癌细胞对化疗药物产生耐药。有研究证明索拉非尼通过抑制SLC7A11特异性激活铁死亡。因此本研究中，作者在体内和体外研究了ABCC5在索拉非尼耐药HCC中的作用。
结果
1、 索拉非尼诱导人HCC细胞中ABCC5表达
首先，作者绘制了索拉非尼耐药的HCC细胞与未治疗的HCC细胞之间差异表达基因的热图，发现耐药HCC细胞的ABCC5表达显著升高（图1A）。接下来，为了确定索拉非尼对ABC家族的影响，作者用索拉非尼处理HuH7细胞（人HCC细胞系）24小时，通过qRT-PCR分析ABC家族的mRNA水平，发现索拉非尼处理后，ABCC1、ABCC3和ABCC5的表达水平升高较显著（图1B），同时WB显示，索拉非尼处理后，HuH7细胞中ABCC5的表达明显增加（图1C）。作者还用索拉非尼处理其他HCC细胞系(HepG2和Sk-Hep-1细胞)，qRT-PCR和WB分析显示，ABCC5的表达同样的增加了（图1D、E）。接下来，作者用含索拉非尼的完全培养液培养HCC细胞系，获得耐药的HCC细胞，分别命名为HuH7-SR和Sk-Hep- 1-SR（图1F）。同时作者还计算得到两株耐药细胞株的IC50值分别为9.804±0.995 μM和9.564±1.152μM，明显高于HuH7-WT(4.851±0.293μM)和Sk-Hep- 1- WT(3.732±0.262 μM)(图1G)。为进一步验证索拉非尼耐药细胞株的可靠性，作者还采用流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与WT细胞相比，SR细胞具有明显的耐药性(图1H)， qRT-PCR和WB分析显示，SR细胞中ABCC5的表达均高于WT细胞(图1I,J)。同时体内实验即作者将HuH7-WT和HuH7-SR细胞分别植入裸鼠左右侧皮下空间，并从第7天开始，让这些小鼠接受索拉非尼治疗。与对照HuH7-WT组相比，索拉非尼并没有使HuH7-SR组肿瘤的大小和重量降低(图1 K, L)，而且HE染色和免疫组化显示，HuH7-SR组的ABCC5表达明显高于HuH7-WT组(图1M)，即说明索拉非尼显著诱导人HCC细胞中ABCC5的表达。
图1
2、 索拉非尼诱导的ABCC5表达需要PI3K/AKT/NRF2通路的激活
WB显示，索拉非尼可以特异性诱导HuH7细胞和Sk-Hep-1细胞中PI3K/AKT通路的激活(图2A)。核因子红系2相关因子2 (NRF2)是PI3K/AKT通路的下游靶点，可以保护细胞免受多种损伤并介导抗氧化。为了确定短期索拉非尼处理能否激活HuH7细胞中的PI3K/AKT或增加NRF2的表达，作者用索拉非尼处理细胞24小时后停药，发现停药后这些表达水平恢复（图2B）。WB还显示，PI3K/AKT通路激动剂SC79和SB216763显著上调了NRF2和ABCC5,而经PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理后，HuH7细胞中NRF2的表达降低，这些表明AKT通路正向调控NRF2(图2C)。同时与HuH7- WT细胞相比，作者发现HuH7-SR细胞中p-PI3K、p-AKT、NRF2的表达增加，而LY294002处理降低了HuH7-SR细胞中NRF2的表达，即表明AKT通路正向调节了索拉非尼耐药的HCC细胞中的NRF2(图2 D、E)。免疫荧光也显示，在HuH7-SR中，NRF2的荧光强度增强，尤其是在细胞核中，而LY294002能显著降低了NRF2的表达，进一步表明长期索拉非尼处理可以激活PI3K/AKT/NRF2通路(图2F)。qRT-PCR分析和生物信息学数据(GEPIA2网站)显示，ABCC5和NRF2在HCC中显著相关(S1)。此外作者使用靶向特异性siRNAs干扰NRF2(图2G, H)或用NRF2抑制剂(ML385和Brusatol)处理后，WT和SR细胞中ABCC5的表达均显著降低(图2I, J)，这表明NRF2对索拉非尼诱导的ABCC5表达是必需的。细胞活力实验表明，AKT/NRF2通路抑制剂24 h内能显著提高索拉非尼诱导的细胞死亡 (图2K)。此外，作者通过免疫组化(IHC)评估各组肝癌组织中p-PI3K、NRF2和ABCC5的表达，显示与对照组相比，HuH7-WT组中p-PI3K、NRF2和ABCC5表达水平显著升高(图2L)。这些数据表明，索拉非尼诱导的ABCC5表达需要激活PI3K/AKT/NRF2通路。
图2
S1
3、 ABCC5在体外介导对索拉非尼的获得性耐药性
为了确定ABCC5的表达是否影响索拉非尼的抗癌活性，作者将靶向ABCC5的sgRNA（敲低）和慢病毒载体ABCC5转染（过表达）到Sk-Hep-1和HuH7细胞(图3A，B)。首先，为了评估ABCC5对索拉非尼在细胞内转运的影响，作者用索拉非尼处理HuH7-SR和过表达ABCC5的HuH7细胞，并采用LC-MS检测，作者发现过表达ABCC5对HuH7细胞中索拉非尼细胞间浓度及其代谢物M3、M4、M5细胞内浓度均无显著影响(P>0.05)(图3C)，而耐药株HuH7-SR的索拉非尼及其代谢物水平与HuH7-WT相比增加(图3D)。这些数据表明ABCC5对索拉非尼的外排作用并不是引起索拉非尼耐药的主要机制。HuH7细胞中过表达ABCC5可显著抑制索拉非尼诱导的细胞毒性，而ABCC抑制剂MK571可有效恢复索拉非尼诱导的细胞毒性，作者发现敲低和抑制ABCC5的表达可以进一步增强索拉非尼对Sk-Hep-1细胞的细胞毒性(图3E)。此外，作者还使用靶向ABCC5的sgRNA来干扰阻断HuH7-SR细胞中增加的ABCC5表达(图3F)。集落形成实验也表明，抑制ABCC5的表达可以抑制索拉非尼处理后的HuH7-SR细胞的长期增殖(图3G)。这些结果表明，ABCC5介导了体外HCC细胞对索拉非尼的获得性耐药。
图3
4、 ABCC5是铁死亡的负调控因子，有助于细胞对索拉非尼耐药
作者发现索拉非尼诱导HCC细胞脂质过氧化积累和线粒体损伤（S2A，B）并抑制HCC细胞中SLC7A11和GPX4（S2C）的表达。而铁死亡抑制剂Fer-1 和 DFO 显着恢复了索拉非尼抑制的 HCC 细胞活力（S2D）。接下来，作者进一步研究了 ABCC5 是否参与调节导致索拉非尼耐药的脂质过氧化和线粒体损伤。ABCC5过表达显著抵消了索拉非尼诱导的HuH7细胞脂质过氧化积累和线粒体膜电位(MMP)降低，而铁死亡抑制剂Fer-1和DFO可以部分改善索拉非尼处理的HuH7细胞的脂质过氧化和线粒体损伤(图4A)。此外，作者用sgRNA抑制ABCC5表达可以减轻索拉非尼处理的Sk-Hep-1细胞和HuH7-SR细胞的脂质过氧化，增强MMP，而Fer-1和DFO部分减轻了索拉非尼处理的HuH7-SR细胞和ABCC5敲低的Sk-Hep-1细胞的脂质过氧化和线粒体损伤(图4 B,C)。总之，这些结果表明，ABCC5通过抑制脂质过氧化和增加MMP负调控铁死亡，这有助于肝癌细胞对索拉非尼的耐药。
S2
图4
5、 ABCC5通过稳定SLC7A11负调控铁死亡
已知索拉非尼通过抑制 SLC7A11（胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白的一种特定轻链亚基）来增加细胞内脂质过氧化水平。接下来，作者探讨了 ABCC5 是否可以与 SCL7A11 相互作用以调节铁死亡。基于starBase数据库的生物信息学分析显示ABCC5与SLC7A11显着相关（S3）。同时免疫荧光分析显示ABCC5与SLC7A11共定位，ABCC5的敲低降低了HuH7、Sk-Hep-1和HuH7-SR细胞中SLC7A11的表达（图4D），在 WT和 SR 细胞中通过 co-IP 测定检测到 ABCC5 与 SLC7A11 的相互作用（图4E），同时WB显示SLC7A11在索拉非尼抗性细胞中高度表达（图5A），而且ABCC5的敲低抑制了HuH7-SR细胞中SLC7A11蛋白的表达（图5B），SLC7A11的抑制或过表达能降低或增加ABCC5的表达（图5C）。接下来，作者使用自噬抑制剂氯喹（CQ）和蛋白酶体降解抑制剂MG132来确认ABCC5保护SLC7A11不被自噬降解（S4）。因为NRF2 通过限制ROS水平的升高和减少细胞对铁的吸收来负调控铁死亡，作者使用 STRING 数据库的分析表明，NRF2 可能与 ABCC5 和 SLC7A11 相互作用，可能作为中介（S5）。作者用索拉非尼与 ML385、brusatol 或 MK571 联合治疗逆转了索拉非尼在 HuH7-SR 细胞中诱导的 ABCC5 和 SLC7A11 的过表达，而与 SLC7A11 抑制剂erastin 联合治疗效果不好（图5D，E）。相同的是，ABCC5的敲低增加了用索拉非尼和/或erastin处理的HuH7-SR细胞中的GSH消耗，减轻了脂质过氧化和GPX4表达（图5F，G）。此外，细胞内胱氨酸含量表明ABCC5可以进一步增强SLC7A11蛋白对胱氨酸的摄取和GSH的产生（S6）。为了测试索拉非尼抗性是否通过NRF2/ABCC5/SLC7A11轴介导，作者通过WB检测了HuH7-SR细胞中ABCC5和铁死亡相关蛋白的表达，数据表明，NRF2/ABCC5/SLC7A11 轴在分别用抑制剂 LY294002、Brusatol、MK571、erastin或 RSL3 处理的 HuH7-SR 细胞中受到抑制（图 5H）。因此，在被 NRF2 转录激活后，ABCC5 与 SCL7A11 相互作用以负调节铁死亡。
S3
图5
S4
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S6
6、 ABCC5基因的下调可增强索拉非尼在肝癌耐药细胞体内的抗癌活性
为了确定 ABCC5表达的抑制是否导致体内对索拉非尼的耐药性，作者将对照HuH7-SR 细胞 (i)和ABCC5 敲低 HuH7-SR细胞 (ii和iii) 植入裸鼠右侧的皮下间隙，从第7天开始，三组用索拉非尼治疗，第iii组也用erastin治疗。与对照组相比，索拉非尼治疗有效地减少了ii组中ABCC5敲低细胞形成的肿瘤的大小和重量。此外，与ii组相比，额外使用了erastin 治疗的 iii 组中肿瘤的大小和重量均减少了（图6A、B、C）。免疫组化显示ii和iii组小鼠的肿瘤中SLC7A11和 GPX4 的表达降低（图6D）。临床上，TCGA 分析显示，HCC 组织中ABCC5的表达高于正常肝组织（S7，P<0.05）。与此一致的是，与正常肝组织相比，IHC 证实了 HCC 组织中更高的ABCC5 表达（图6E，P<0.05）。此外，IHC 还表明 NRF2、ABCC5 和 SLC7A11 表达在 HCC 组织中显著相关（图6F，P<0.05）。而且基于TCGA 数据的 Kaplan-Meier 生存曲线表明，ABCC5低表达的 HCC 患者的 OS 优于 ABCC5 高表达的 HCC 患者（S8）。
图6
S7
S8
总结
综上，作者证明ABCC5积累可保护HCC细胞对抗索拉非尼，并通过抑制脂质过氧化介导的铁死亡促进癌症发展(图7)。作者还发现抑制ABCC5表达和促进铁死亡可显著增强索拉非尼在体内的抗癌活性。因此，通过调控ABCC5的表达来诱导铁死亡是克服肝癌细胞获得性索拉非尼耐药的一种潜在治疗策略。
图7
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