导读
当氧含量低时，HIF-1α的量增加，因此它可以结合并调节EPO基因以及其他具有HIF结合DNA片段的基因。这一机制为我们理解氧气水平如何影响细胞代谢和生理功能奠定了基础。研究人员进一步发现负责关闭细胞天然“自杀”信号的基因可能也是导致乳腺癌和黑色素瘤细胞对使用免疫系统抵抗癌症的疗法产生抗药性的罪魁祸首。当BIRC2的基因被过度驱动时，它会使蛋白质水平过多或“过度表达”。这种情况发生在大约40％的乳腺癌中，尤其是致命性更高的三阴性乳腺癌类型，并且尚不清楚该基因在黑素瘤中过表达的频率。免疫治疗点阻断可带来治疗反应，但对于大多数癌症患者，由于癌细胞固有的耐药机制，免疫疗法无效。研究人员报告指出，黑素瘤或乳腺癌细胞中的BIRC2敲低极大地改变了免疫细胞肿瘤的微环境，并增加了对抗CTLA4和/或抗PD1治疗的敏感性。研究重点：1. BIRC2抑制黑素瘤和乳腺癌细胞中的CXCL9 mRNA和蛋白表达；2. BIRC2减少了肿瘤内激活的CD8 + T细胞和NK细胞的数量；3. BIRC2可增加具有免疫能力的小鼠的乳腺肿瘤生长，但不会增加免疫缺陷的小鼠的乳腺肿瘤生长；4. BIRC2损害抗CTLA4和/或抗PD1免疫检查点封锁的功效。
论文ID
标题：BIRC2 Expression Impairs Anti-Cancer Immunity and Immunotherapy Efficacy.
译名：BIRC2的表达削弱了抗癌免疫力和免疫疗法的功效。
期刊：Cell reports
IF: 8.109（Q1）
发表时间：2020.08.25
通讯作者：Gregg Semenza
通讯作者单位：约翰霍普金斯大学医学院
翻译：Med-SCI（翻译偷懒，很多错误，还望各位好汉多指点！）
摘要
免疫检查点阻断（剂）（Immune checkpoint blockade ，ICB）引起了一些以前没有有效的治疗方法的癌症患者体内的治疗反应。ICB作用于那些由于检查点信号失活的T淋巴细胞及其他免疫细胞，这些信号抑制了它们在肿瘤中的浸润和功能。但是对于超过80％的患者，免疫疗法是无效的。在这里，作者展示了免疫逃避以及对含杆状病毒IAP重复结构2（BIRC2）分子介导的ICB抗性在癌细胞的内在机制。降低小鼠黑素瘤或乳腺癌细胞中BIRC2表达，可通过增加肿瘤内激活的CD8 +T细胞和NK细胞数量来增加趋化因子CXCL9的表达，并损害肿瘤的生长。抗CXCL9中和抗体的给药可抑制CD8 + T细胞和NK细胞向“BIRC2缺失的肿瘤”募集。最重要的是，BIRC2的缺失显著提高了小鼠黑素瘤和乳腺癌对抗CTLA4或抗PD1-ICB的敏感性。
关键词：抗肿瘤免疫，癌症免疫抑制，缺氧诱导因子，NF-κB，肿瘤微环境
介绍
针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4），程序性死亡1（PD1）受体或程序性死亡配体1（PDL1）进行免疫检查点阻断（ICB）的癌症免疫疗法已证明在癌症治疗中具有前所未有的临床疗效，甚至其在多种肿瘤类型中的生物活性和反应的持久性在患有转移性和化疗耐药性癌症的患者中同样如此。但是，仅在15％–20％的患者中观察到了这些益处。鉴于越来越多的癌症患者正在接受ICB治疗，其潜在的益处可惠及晚期恶性肿瘤患者，阐明耐药性基础的机制是癌症免疫治疗的主要挑战。了解原发性和适应性耐药机制后将转化为有效的、科学驱动的联合免疫疗法。尽管出现了许多将免疫抑制肿瘤微环境（TME）转化为支持抗肿瘤免疫力并可以克服T细胞被抑制的内在机制的策略，但我们对于使T细胞失能的癌细胞内在抑制机制了解较少。阐明对ICB的耐药性机制将建立新的治疗靶标。
对治疗性黑色素瘤活检的分析表明，原发抗性肿瘤显示出由细胞暴露于缺氧引起的乏氧基因的高表达。耐药性肿瘤转录组中标记乏氧基因存在表明，靶向缺氧反应途径的成员可以克服黑色素瘤中对ICB的耐药性。低氧症经常发生在晚期癌症中，而肿瘤的乏氧症与患者死亡率增加相关，这是由缺氧诱导因子（HIF）激活介导癌症进展关键方面的基因（例如血管生成，代谢改变，侵袭，转移和癌干细胞增殖分化）激活所致。癌细胞暴露于缺氧状态也会诱导HIF依赖性基因表达，从而有助于逃避抗肿瘤免疫力。然而，尚未证明HIF或HIF靶基因在介导癌细胞对ICB的内在抗性中的直接因果作用。
最近，据报道，PBRM1（一种染色质重塑因子）的表达通过控制干扰素刺激的基因表达来促进癌细胞的免疫抵抗。RNA测序（RNA-seq）分析显示，缺氧相关蛋白在PBRM1敲除细胞中被下调。两项研究确定了凋亡抑制蛋白1（cIAP1）的细胞抑制剂，也称为杆状病毒含IAP重复序列2（BIRC2），作为在癌细胞内源基因筛选中鉴定出的许多潜在靶标之一，这些基因的缺失使体外对T细胞杀伤的敏感性增加。BIRC2是一种E3泛素蛋白连接酶，可调节核因子κB（NF-κB）信号传导并抑制细胞凋亡。但是，尚未确定BIRC2促进癌细胞免疫逃逸的特定分子机制。
在本文中，我们报道低氧诱导乳腺癌和黑色素瘤细胞中BIRC2的表达增加，敲除BIRC2可增加CXCL9的表达——CXCL9是一种趋化因子，可将CD8+T细胞和自然杀伤（NK）细胞募集到肿瘤中。敲低BIRC2表达（BIRC2-KD）可以通过使肿瘤更具免疫原性来抑制同基因小鼠的肿瘤生长。最重要的是，BIRC2-KD使黑色素瘤和乳腺癌对ICB敏感。
结果
一项研究确定了325个基因，这些基因赋予B16F10小鼠黑素瘤细胞抵抗T细胞介导的致细胞死亡。我们假设缺氧是TME的一项关键功能，它可以保护癌细胞免受T细胞介导的杀伤。根据以前的报道，在325个基因中，我们鉴定出38个基因在一种或多种细胞类型中具有HIF依赖性，低氧诱导表达（图1 A）。我们先前确定了由HIF-1α的mRNA和13个HIF目标基因mRNA（PLOD1，VEGFA，LOX，P4HA2，NDRG1，SLC2A1，ERO1L，ADM，LDHA，PGK1，ANGPTL4，SLC2A3和CA9）组成的HIF签名乳腺癌死亡率。我们以前的经验表明，低氧诱导的基因通常在乳腺癌细胞中依赖于HIF，而低氧诱导的基因与人类乳腺癌活检组织中的HIF特征具有显著相关的表达。但是，这种表征在黑色素瘤中的预测能力尚未得到验证。我们使用Pearson相关检验（来自于癌症基因组图谱（TCGA）数据库的1,247个乳腺癌和481个黑色素瘤，分析了这38个基因中任何一个的表达是否与HIF信号的表达相关。在乳腺癌和黑素瘤中，11个基因（BIRC2，ERO1L，GPI1，ITGAV，JMJD6，MCL1，NAMPT，SLC2A1，SLC7A11，SOD2和UGP2）的表达与HIF特征呈高度显著正相关（p <0.0001）。（表S1）。由于ERO1L和SLC2A1是HIF特征的一部分，因此未继续深入研究。JMJD6——组蛋白的双精氨酸脱甲基酶和赖氨酰羟化酶，没有考虑进一步研究是因为表观遗传调节已经显示出可以提高抗PD1治疗的功效。SLC7A11增加癌细胞对葡萄糖的依赖性，并且已经证明靶向糖酵解基因可以提高抗PD1治疗的疗效。选择其余七个基因进行进一步分析。
除小信号外，大多数HIF靶基因是由缺氧以细胞类型限制的方式诱导的。实际上，甚至在乳腺癌细胞系之间，HIF靶基因的the battery也有所不同。为了进一步证实相关细胞类型中的七个候选基因，我们将两种小鼠乳腺癌细胞系（4T1和EMT6）和黑色素瘤细胞系（B16F10）暴露于20％或1％O 2达24小时，并通过反向分析mRNA表达转录（RT）和定量PCR（qPCR）。在所有三种癌细胞系中，缺氧至少诱导了4个基因（BIRC2，GPI，ITGAV和NAMPT）的表达2倍的表达（图1 B-1D）。为了完善我们的清单，我们将B16F10和EMT6细胞暴露于20％或1％O 2中48小时，并进行了免疫印迹分析。黑色素瘤和乳腺癌细胞均仅诱导BIRC2蛋白表达（图1 E）。
（A）示出选择BIRC2的原理的流程图。根据先前报道的低氧诱导表达以及与乳腺癌和黑素瘤中已知HIF靶基因表达（HIF特征）的高度显著相关性，过滤了325个基因，其中KO使B16F10细胞对T细胞杀伤敏感。（B–D）剩余的七个基因分析如下。将B16F10（B），EMT6（C）和4T1（D）细胞暴露于20％或1％O 2达24 h，编码BIRC2，ITGAV，GPI，UGP2，MCL1，NAMPT和SOD2的mRNA通过相对于18S rRNA的qRT-PCR，然后根据暴露于20％O 2细胞的结果标准化（平均值±SEM；n = 3）；与基线相比（与Bonferroni后测的双向方差分析），∗ p <0.001。下划线的基因名称表示在1％O 2表达显着增加。（E）BIRC2（和肌动蛋白作为上样对照）在B16F10细胞（上图）和EMT6细胞（下图）制备的全细胞裂解物中的免疫印迹测定，将其暴露于20％或1％O 2 48小时。
唯一暗示BIRC2作为HIF靶基因的证据是来自单个微阵列研究的大量数据报道BIRC2基因在0.5％的乳腺癌中扩增。但是，BIRC2 mRNA在40％的乳腺癌中过表达，表明在大多数乳腺癌中BIRC2过表达都必须依靠基因扩增以外的机制。为了研究缺氧是否以HIF依赖的方式调节BIRC2的表达，黑素瘤和乳腺癌细胞在不存在或存在acriflavine的情况下暴露于1％O 2 24小时，而acriflavine与HIF-1α和HIF-2α结合并阻断它们与HIF-1β异源二聚化，从而抑制HIF依赖性转录。在B16F10细胞（图2 A）和EMT6细胞（图2 B）中，缺氧诱导BIRC2 mRNA表达被acriflavine抑制。相比之下，RPL13A（不受HIF调控的基因）的表达不受 acriflavine的抑制（图 S1A 和S1B），表明acriflavine对BIRC2表达的选择性抑制，如先前针对其他HIF靶基因的报道。缺氧诱导的BIRC2表达（图S1 C）而不是RPL13A表达（图S1 D）也被4T1细胞中的acriflavine抑制。
为了补充这种药理学方法，使用CRISPR-Cas9技术在B16F10细胞中消除了HIF-1α和HIF-2α的表达。将野生型（WT）和双敲除（DKO）细胞暴露于20％或1％O 2 48小时，并通过免疫印迹测定BIRC2和HIF-1α蛋白的表达。缺氧诱导的两种蛋白的表达在DKO细胞中丢失（图2 C）。为了测试在人类乳腺癌中BIRC2是否以HIF依赖性方式被调控，将具有HIF-1α或HIF-2α或DKO敲除（KO）的MDA-MB-231细胞暴露于20％或1％O 2中24 H。低氧诱导WT细胞中BIRC2 mRNA表达，但HIF-1αKO，HIF-2αKO或DKO消除了这种诱导效果（图2D）。因此，遗传和药理学方法表明，当乳腺癌和黑色素瘤细胞缺氧时，HIF会激活BIRC2表达。
接下来，我们研究了HIF-1还是HIF-2是否直接与BIRC2基因结合。匹配共有HIF结合位点序列5'-（A / G）CGTG-3'，然后通过在MDA-MB-231细胞中进行的染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析评估HIF结合。低氧诱导HIF-1（即HIF-1α+HIF-1β）和HIF-2（即HIF-2α+HIF-1β）与BIRC2内含子2 的区域串联，该区域包含串联HIF结合位点，间隔为5 bp （图2 E）。这些数据表明，HIF-1和HIF-2 均可直接激活缺氧MDA-MB-231细胞中的BIRC2转录，为BIRC2在人类乳腺癌中的过度表达提供了潜在的分子机制。
（A和B）将B16F10细胞（A）和EMT6细胞（B）暴露于20％或1％O 2与指定浓度（0、1和5μM）的Acr混合24小时。相对于18S rRNA定量BIRC2 mRNA水平，并标准化至暴露于20％O 2的细胞（平均值±SEM；n = 3）；两组之间的∗ p <0.01（采用Bonferroni后测的双向ANOVA）。（C）从野生型（WT）和双敲除（DIF）（HIF-1α和HIF-2α）B16F10细胞制备的裂解物的免疫印迹测定，将其暴露于20％或1％O 2 48小时。
（D）分析MDA-MB-231细胞（WT）或具有HIF-1α或HIF-2α的KO或具有DKO的细胞中的BIRC2 mRNA表达，所述细胞暴露于20％或1％O 2 24小时。数据以20％O 2下的WT标准化（平均值±SEM；n = 3）；两组之间的∗ p <0.01（采用Bonferroni后测的双向ANOVA）。（E）将MDA-MB-231细胞暴露于20％或1％的O 2中24小时，并且使用IgG或针对HIF-1α，HIF-1β或HIF-2α的抗体进行ChIP测定。候选HIF结合位点侧翼的引物用于qPCR，结果标准化至泳道1（平均值±SEM；n = 3）；∗ p <0.01 vs 20％O 2（采用Bonferroni后测的双向ANOVA）。显示了包含两个HIF结合位点（红色）并位于BIRC2基因内含子2内的核苷酸序列（非编码链）。
因为据报道BIRC2发挥免疫调节作用，我们假设BIRC2敲低（BIRC2-KD）会导致细胞的细胞因子谱改变。为了检验该假设，用编码5个靶向BIRC2的短发夹RNA（shRNA）之一或非靶向对照shRNA（NTC）的表达载体稳定转染B16F10细胞。通过BIRC2免疫印迹试验研究了干扰效率，结果显示sh3和sh4亚克隆中的BIRC2-KD几乎完整（图3 A）。为了测试BIRC2-KD对细胞因子表达的影响，我们基于qPCR，采用了细胞因子和趋化因子的阵列来分析从B16F10细胞的NTC和BIRC2-KD亚克隆中提取的RNA。CXCL9 mRNA响应BIRC2-KD表现出最大的表达增加（是NTC的8倍）（图3 B；表S2）。使用独立设计的引物通过定量逆转录（qRT）-PCR确认CXCL9 mRNA的表达（图3 C），使用sh4亚克隆的条件培养基（图3 C）通过ELISA在蛋白水平上进行确认。
为了研究确定BIRC2和CXCL9 mRNA水平之间关系的分子机制，我们注意到，据报道BIRC2正调节规范性NF-κB信号传导，而负调节导致CXCL9表达的非规范性NF-κB信号传导。我们使用从NTC和BIRC2-KD亚克隆制备的细胞质和细胞核裂解物，通过免疫印迹分析法分析了NF-κB亚基的亚细胞定位。BIRC2-KD减少了p50和RelA的核定位，这是经典NF-κB信号通路的关键组成部分，并增加了RelB的核定位，这是非经典NF-κB信号通路的关键组成部分（图3） E）。总而言之，图3中显示的数据证明B16F10黑色素瘤细胞中的BIRC2-KD导致增加的非经典NF-κB信号传导和增加的CXCL9表达。
（A）将表达NTC或靶向BIRC2的五个shRNA之一的B16F10亚克隆在20％O 2下培养，并通过免疫印迹测定分析BIRC2蛋白的表达。（B）火山图显示了与NTC相比，BIRC2-KD亚克隆中趋化因子和细胞因子的表达（结果的颜色显示在右侧）。（C和D）在表达NTC或BIRC2 shRNA（sh3或sh4）的B16F10亚克隆中，通过qRT-PCR分析CXCL9 mRNA表达（C）和通过ELISA分析蛋白质（D）。将数据标准化为NTC（平均值±SEM；n = 3）；*与NTC相比p <0.01（采用Bonferroni后测的单向方差分析）。（E）对从B16F10亚克隆制备的细胞裂解物的胞质和核级分进行RelA，RelB，p50和α-微管蛋白的免疫印迹测定。α-管蛋白是一种胞质蛋白，经分析证明其细胞裂解液的纯度。
BIRC2敲低导致CXCL9的表达增加，CXCL9募集表达其同源受体CXC趋化因子受体3（CXCR3）的免疫细胞，包括活化的T细胞和NK细胞。我们假设BIRC2-KD将使肿瘤更具免疫原性，从而损害具有免疫能力的小鼠的肿瘤生长。为了检验该假设，将B16F10的NTC和BIRC2-KD亚克隆皮下注射到同基因C57BL / 6小鼠的右胁腹。B16F10细胞中的BIRC2-KD显著延迟了有免疫能力的小鼠中指数肿瘤生长的发生（图4 A）。
因为BIRC2可以调节先天免疫和适应性免疫，通过多光谱流式细胞术对第35天收获的肿瘤进行了免疫细胞TME分析（门控策略如图S2所示）。B16F10中的BIRC2-KD导致介导抗肿瘤免疫力的细胞类型增加，即激活的T细胞（图4 B），NK细胞（图4 C）和树突状细胞（DC）（图4 D），而M1型肿瘤相关巨噬细胞（M1-TAMs）未改变（图4 E），这是由已建立的细胞表面标志物确定的。肿瘤相关中性粒细胞（TANs），据报道在黑色素瘤中起免疫抑制作用，但在解决肿瘤内缺氧后杀死子宫癌细胞在BIRC2-KD肿瘤中也增加（图 S3A ）。BIRC2-KD不影响免疫抑制性髓样来源的抑制细胞（MDSCs）（图4 F）。
BIRC2 mRNA在肿瘤中的表达（图4 G）与肿瘤潜伏期（图4 A）以及激活的T细胞（图4 B），NK细胞（图4 C）和DC（图4 D）的百分比呈负相关。在TME中，在BIRC2-KD肿瘤中，CXCL9表达显著增加（图4 H），并且CXCL9 mRNA水平与BIRC2 mRNA水平成反比（图4 G）。接下来，我们分析了TIGIT和LAG3的表达（图4 I和4J），它们是T细胞衰竭的标志物。BIRC2-KD亚克隆中的TIGIT和LAG3 mRNA表达显著降低，这与流式细胞仪数据一致，表明BIRC2-KD肿瘤中存在更多的活化T细胞（图4 B）。
鉴于我们的研究结果表明BIRC2-KD肿瘤中DC和活化T细胞均增加，我们调查了人类黑素瘤活检中DC和CD8 + T细胞的水平是否相关。皮尔逊相关检验用于比较基于CD8A，CD8B，IFNG和PRF1 mRNA表达的CD8 + T细胞评分与基于BATF3，CLEC9A，IRF8，THBD和XCR1 mRNA的DC评分的比较表达。在481个TCGA人黑素瘤样本中观察到高度相关（图4 K）。
（A）将表达NTC或BIRC2 shRNA（sh3或sh4）的B16F10亚克隆皮下植入雌性C57BL / 6小鼠中，并监测肿瘤的生长。（B–F）在第35天收获肿瘤，CD8 + / CD44 + / CD69 +活化的T细胞（B），CD11b + /NK1.1 + NK细胞（C），CD11b + / CD11c + / F4的百分比确定了/ 80 - DC（D），CD11b + / F4 / 80 + M1-TAM（E）和CD11b + / Ly6C + MDSC （F）（平均值±SEM; n = 4）; 两组之间的∗ p <0.05（采用Bonferroni后测的单因素方差分析）。计算所有免疫细胞群占活细胞总数的百分比（基于正向和侧向散射）。（G–J）分析从肿瘤组织中分离的RNA，以定量相对于18S rRNA的BIRC2（G），CXCL9（H），LAG3（I）和TIGIT（J）mRNA水平，并对NTC肿瘤标准化（平均值±SEM；n = 4）；两组之间的∗ p <0.01（Kruskal-Wallis检验和Benjamini-Hochberg后期检验）。（K）CD8 + T细胞评分与DC评分之间的相关性。进行Pearson相关检验以比较CD8 + T细胞评分（基于CD8A，CD8B，IFNG和PRF1 mRNA的水平）与DC评分（基于BATF3，CLEC9A，IRF8，THBD和XCR1的水平） mRNA），使用来自481个人类黑色素瘤的TCGA数据。
为了确定BIRC2-KD肿瘤生长减慢是否对黑色素瘤或C57BL / 6宿主菌株具有特异性，我们转向EMT6乳腺癌模型。用编码靶向BIRC2的两个shRNA（称为sh4和sh5）或NTC shRNA的表达载体稳定转染EMT6细胞。敲低效率通过免疫印迹测定法验证（图5 A）。将NTC和BIRC2-KD（sh4和sh5）EMT6亚克隆注入同系BALB / c小鼠的第二个乳腺脂肪垫中。EMT6细胞中的BIRC2-KD显著降低了肿瘤的生长速度（图5 B）。BIRC2-KD导致活化的CD8 + T细胞（图5 C）和NK细胞（图5）浸润增加D）进入EMT6肿瘤，如在B16F10黑色素瘤中观察到的（图4 B和4C）。但是，与B16F10肿瘤相比，BIRC2-KD不会影响DC向EMT6肿瘤的募集（图5 E）。与黑色素瘤模型一样，MDSCs没有显着变化（图5 F），而TAN募集增加（图S3 B）。我们的结果表明，如在黑色素瘤中观察到的那样，BIRC2-KD通过增加介导抗肿瘤免疫力的活化T细胞和NK细胞进入TME来损害乳腺癌的生长。
为了测试观察到的BIRC2-KD对肿瘤生长的影响是否是免疫介导的，将EMT6的NTC和两个BIRC2-KD亚克隆注入缺乏适应性免疫力的雌性重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠的乳腺脂肪垫中。与具有免疫功能的BALB / c宿主中的肿瘤生长相反（图5 A），在免疫缺陷小鼠中NTC和BIRC2-KD亚克隆之间的肿瘤生长没有差异（图5 G）。
（A）在20％O 2下培养表达NTC的EMT6亚克隆或两个靶向BIRC2的shRNA（sh4和sh5）之一，并通过免疫印迹分析分析BIRC2蛋白的表达。（B）将EMT6亚克隆（NTC，sh4和sh5）植入雌性BALB / c小鼠的乳腺脂肪垫中，并测定肿瘤体积（平均值±SEM；n ＝ 4）。∗ p <0.05（使用Benjamini-Hochberg后测的Kruskal-Wallis测验）。（C-F）收获肿瘤在第13天，和CD8的百分率+ / CD44 + / CD69 +激活的T细胞（C），CD3 - /NK1.1 + NK细胞（d），CD11b的+ / F4 / 80 - / CD11c + DCs（E）和CD11b + / Ly6C + MDSCs（F）的测定（平均值±SEM；n ＝ 4）；对于指定的对，∗ p <0.05（Kruskal-Wallis检验和Benjamini-Hochberg后检验）。计算所有免疫细胞群占活细胞总数的百分比（基于正向和侧向散射）。（G）将EMT6亚克隆植入雌性SCID小鼠的乳腺脂肪垫中，并监测肿瘤的生长。
为了测试CXCL9在调节抗肿瘤免疫中的功能作用，将B16F10 NTC和BIRC2-KD亚克隆皮下注射到同基因C57BL / 6小鼠的腹侧面。当BIRC2-KD肿瘤变得明显时，将小鼠用抗CXCL9抗体或同种型（免疫球蛋白G [IgG]）作为对照。植入NTC细胞的小鼠未经治疗。如先前观察到的（图4A），在用同型对照治疗的小鼠中，BIRC2-KD肿瘤指数生长之前的潜伏期比NTC亚克隆（图6A）长一周。与IgG治疗相比，抗CXCL9抗体治疗不会改变BIRC2-KD肿瘤延长的潜伏期，但会增加肿瘤指数增长率（图6A）。抗体治疗对体重没有影响（图S3 C）。
为了测试BIRC2-KD是否通过CXCL9信号传导使肿瘤更具免疫原性，通过多光谱流式细胞仪分析了免疫细胞TME。与用IgG治疗的BIRC2-KD肿瘤相比，用抗CXCL9抗体治疗可减少CD8 + T细胞（图6 B），活化T细胞（图6 C）和NK细胞（图6 D）的浸润。然而，用抗CXCL9抗体治疗对DCs 向肿瘤的浸润没有显着影响（图 6E）。
为了研究CXCL9表达是否与人黑色素瘤中的CD8 + T细胞和NK细胞募集相关，我们分析了TCGA黑色素瘤基因表达数据。CD8 + T细胞评分与CXCL9 mRNA水平高度相关（图6 F），强烈表明我们的实验结果具有临床意义。最近，开发了一种NK细胞信号，可预测黑色素瘤患者的生存获益。NK细胞表征（signature）由20个基因组成（XCL2，XCL1，PRF1，NKG7，NCR1，KLRK1，KLRF1，KLRD1，KLRC3，KLRB1，KIR2DL4，IL2RB，IL18RAP，GZMA，GZMB，GZMH，FASLG，CTSW，CD244，和CD160）与CXCL9 mRNA水平高度相关（图6 G），有力地支持了我们实验结果的临床意义。我们还分析了TCGA乳腺癌基因表达数据，发现CD8 + T细胞评分和NK细胞评分均与CXCL9 mRNA表达高度相关，表明CXCL9在NK和CD8 + T细胞募集中也起重要作用对人类乳腺癌（图S4）。
DC评分也与黑色素瘤中的CXCL9 mRNA水平高度相关（图6 H）。但是，我们没有看到阻断CXCL9对DC向B16F10肿瘤募集的任何作用（图6 E）。这些结果与以下报道一致：除癌细胞外，DC还分泌CXCL9，从而有助于CD8 + T细胞和NK细胞的募集。因此，DC在CXCL9表达的上游，而T细胞和NK细胞在下游。总之，数据表明由BIRC2-KD癌细胞产生的CXCL9直接募集活化的T细胞和NK细胞。
（A）将NTC和BIRC2-KD亚克隆植入C57BL / 6小鼠。当BIRC2-KD肿瘤变得明显时，每3天用抗CXCL9或IgG治疗小鼠。测定肿瘤体积（平均值±SEM；n = 4）；∗ p <0.05（使用Benjamini-Hochberg后测的Kruskal-Wallis测验）。（B-E）收获肿瘤在第35天，和CD8的百分率+ T细胞（相对于CD45 +群体）（B），CD8 + / CD44 + / CD69 + T细胞（C），CD3 - / NK1。测定1 + NK细胞（D），并测定CD11b + / CD11c + / F4 / 80 - DC（E）（平均值±SEM；n = 4）；∗ p <0.05（使用Benjamini-Hochberg后测的Kruskal-Wallis测验）。计算所有免疫细胞群（B除外）占活细胞总数的百分比（基于正向和侧向散射）。（F–H）使用来自481个人类黑素瘤的TCGA数据，进行Pearson相关性测试，比较CXCL9 mRNA表达与CD8 + T细胞评分（F），NK细胞评分（G）和DC评分（H）。
基于观察到的免疫TME的变化，我们假设BIRC2-KD会增加B16F10肿瘤对免疫疗法的敏感性。具有抗PD-1和抗CTLA4单克隆抗体的双重ICB已被批准用于治疗晚期黑色素瘤。将B16F10 NTC和BIRC2-KD亚克隆皮下植入同基因C57BL / 6小鼠中。当小鼠发展出明显的肿瘤时，每3天随机将它们接受同种型对照（IgG）或抗PD1 +抗CTLA4抗体。ICB对NTC肿瘤的生长只有中等程度的影响，但会大大损害BIRC2-KD肿瘤的生长（图7 A）。为了理解ICB + BIRC2-KD协同作用的基础，对免疫细胞TME进行了分析。ICB + BIRC2-KD协同增加了CD8 + T细胞向肿瘤的浸润（图S5 A）。仅在BIRC2-KD肿瘤中，ICB也增加了M1-TAM的肿瘤浸润（图S5）B）。但是，与BIRC2-KD的显著影响相反，ICB对DC种群没有影响（图S5 C）。总之，我们的结果表明，在黑色素瘤中，与单独使用ICB相比，ICB和BIRC2-KD的组合显着提高了适应性（T细胞）和先天性（M1-TAM）抗肿瘤免疫力。
（A）将B16F10亚克隆（NTC和sh4）皮下植入C57BL / 6小鼠。当小鼠出现明显的肿瘤时，每3天用抗CTLA4 +抗PD1抗体（每种200μg）或IgG（400μg）治疗，并监测肿瘤的生长（平均值±SEM；n = 4）。* P <0.05组（Kruskal-Wallis检验用的Benjamini-Hochberg的后试验）之间。（B）将EMT6亚克隆（NTC和sh5）植入雌性BALB / c小鼠的乳腺脂肪垫中。当出现明显的肿瘤时，每3天用抗PD1抗体或IgG（200μg）治疗小鼠，并监测肿瘤的生长（平均值±SEM；n = 5）。* P <0.05组（Kruskal-Wallis检验用的Benjamini-Hochberg的后试验）之间。
三阴性乳腺癌（TNBC）患者缺乏雌激素受体，孕激素受体和HER2的表达，因此不适合进行靶向治疗。最近，抗PDL1抗体被批准用于TNBC。然而，无论PD-L1状态如何，其应答率都较低，表明需要更有效的免疫疗法。将EMT6（TNBC的小鼠模型）的NTC和BIRC2-KD亚克隆注入同系BALB / c小鼠的乳腺脂肪垫中。当出现明显的肿瘤时，将小鼠随机分组，并在第1、4、7和10天用抗PD-1或同种型对照（IgG）抗体治疗。抗PD1治疗显著降低BIRC2-KD肿瘤的生长，但不降低NTC肿瘤的生长（图7 B）。与IgG相比，抗PD1抗体治疗可显著降低BIRC2-KD肿瘤（而非NTC肿瘤）的最终体积（图7 B）和重量（图S6 A）。抗PD1治疗显著增加CD8的浸润+ T细胞（图S6 B）和BIRC2-KD肿瘤而非NTC肿瘤中激活的T细胞（图S6 C），M1-TAM（图S6 D）和细胞毒性NK细胞（图S6 E）的百分比增加。抗PD1抗体疗法可降低NTC和BIRC2-KD肿瘤中免疫抑制调节性T（T reg）细胞的百分比（图S6 F）。BIRC2-KD（但不是抗PD1抗体治疗显著降低了MDSC的百分比（图S6 G）。BIRC2-KD和抗PD1抗体治疗均未对肿瘤内CD4 +的CD45 +细胞比例产生显著影响（图S6H）。总之，这些数据表明，BIRC2-KD通过将适应性和先天免疫TME从免疫抑制转变为主动抗肿瘤免疫，显着提高了抗PD1治疗的疗效。
讨论区
临床研究表明，缺氧诱导基因在癌细胞中的表达增加与对ICB的耐药性相关，但这种关联的机械基础尚未确定。体外和体内筛选表明，BIRC2表达的丧失可能会增加癌细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性，但尚未报告对免疫TME的详细分析。将这些体外观察结果扩展到小鼠黑素瘤和乳腺癌模型，我们证明了沉默BIRC2会导致发炎的肿瘤，并且我们描述了BIRC2-KD使乳腺癌和黑素瘤更具免疫原性的细胞和分子机制。此外，我们证明靶向BIRC2可提高ICB在乳腺癌和黑色素瘤中的功效。临床上目前所有已批准的抗癌免疫疗法，例如PD1或CTLA4阻断，以及其他形式的免疫疗法，例如癌症疫苗或过继性T细胞疗法，都依赖于细胞毒性T细胞作为主要的效应机制。如乳腺癌所示，靶向BIRC2具有提高许多患者免疫疗法疗效的潜力，其中BIRC2在40％的病例中过表达。
在这项研究中，我们使用了HIFsignature，该signature是基于对缺氧诱导的参与乳腺癌转移的基因进行分析而开发的。我们的基因特征与高预后性缺氧元基因重叠（13个中的8个），该基因是通过选择在多种癌症中一致共表达的低氧诱导基因而获得的。当前的研究表明，我们的HIFsignature可用于黑色素瘤以及乳腺癌，并且使我们能够鉴定325个基因中的11个候选基因，最终我们从中发现BIRC2满足我们最严格的标准。但是，此候选列表可能包含其他有助于免疫逃逸的HIF目标基因。
我们的结果表明低氧乳腺癌细胞中HIF-1和HIF-2 对BIRC2表达的转录激活，这可能解释了为什么BIRC2过表达很普遍，因为晚期乳腺癌的中位pO 2仅为10 mm Hg（1.5％O 2）。然后，我们证明了BIRC2-KD对肿瘤生长的显著作用。我们的研究表明，BIRC2表达的丧失足以通过免疫介导的机制抑制乳腺癌或黑色素瘤的生长。对于EMT6，NTC和BIRC2-KD肿瘤之间的生长率差异完全取决于适应性免疫的观察是出乎意料的，因为人们认为BIRC2通过抑制caspase-3和caspase-7具有更普遍的抗凋亡作用最近的研究表明，肿瘤浸润的CD8 + T细胞与抗PD1治疗的阳性反应相关。趋化因子调节不同免疫细胞亚群向肿瘤的浸润，因此，这些分泌的蛋白质在TME中建立抗肿瘤免疫或免疫抑制中起关键作用。基于此原理，假设靶向趋化因子的疗法可与现有的癌症疗法（包括当前的免疫疗法）协同作用。在本研究中，我们已经证明了BIRC2-KD通过增加癌细胞CXCL9的产生来改变免疫细胞TME的机制，CXCL9募集表达其同源受体CXCR3的免疫细胞，包括活化的T细胞和NK细胞。报道显示，表观遗传调控因子EZH2（PRC2复合体的成员）和ARID1A（SWI / SNF复合体的成员）在调节Th1型趋化因子（包括CXCL9）的表达以及抗肿瘤免疫方面起着关键作用。连同我们的数据，这些结果表明，EZH2或BIRC2的缺失足以恢复CXCL9表达和抗肿瘤免疫力。
在先前的研究中，CXCL9水平升高与黑素瘤以及卵巢癌和结肠直肠癌中CD8 + T细胞的浸润增加有关。我们的结果为这一观察提供了机械基础。需要进一步的研究来确定响应BIRC2抑制而升高的CXCL9水平是否可以预测对ICB的响应性改善。正如BIRC2-KD对经典和非经典NF-κB信号的相互影响所预测的（图3 E），我们证明了BIRC2-KD细胞中其他几种趋化因子的表达增加（图3 B；表S2），这也可能有助于免疫TME的重塑，我们计划在未来的研究中验证这一假设。
我们的结果表明，BIRC2-KD可以显着提高抗CTLA4和/或抗PD-1 ICB的功效。我们没有观察到单独的抗CTLA4和/或抗PD1治疗对B16F10或EMT6肿瘤生长有任何显着影响，而BIRC2-KD则使肿瘤对ICB敏感。我们的结果表明，CD8 + T细胞和NK细胞向TME募集的增加与BIRC2-KD肿瘤对ICB敏感性的增加有关。因此，抑制BIRC2与ICB的结合足以提高乳腺癌和黑色素瘤细胞对先天免疫和适应性免疫系统杀伤的敏感性，这使BIRC2成为有吸引力的免疫调节靶标。我们的结果还表明CD8 +的存在 治疗前的T细胞可能并不是成功完成ICB的必要条件，因为BIRC2-KD会将癌细胞转化为形成免疫抑制的冷肿瘤，而形成癌细胞则形成发炎的热肿瘤，从而克服了B16F10肿瘤对ICB的众所周知的抵抗力肿瘤内缺氧是免疫抑制基质细胞群募集，极化和扩增的主要决定因素。我们的研究阐明了将HIF和BIRC2与ICB治疗耐药性联系起来的新途径（图S6）。但是，我们的研究有几个主要限制。首先，HIFs介导了基础BIRC2表达的增加（这由其他因素决定），而shRNA介导的BIRC2表达几乎完全丧失。其次，我们尚未证明缺氧是诱导该研究所用的乳房和黑色素瘤模型中BIRC2表达的主要信号。第三，尽管有这些限制,我们已经从B16F10黑色素瘤模型中最彻底地证明了BIRC2依赖性抑制CXCL9和抗肿瘤免疫的作用，并从EMT6乳腺癌模型中获得了证实性数据。
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