肿瘤微环境中的新秀：CXCL13 T细胞

人类和癌症斗争也有好几百年的历史了，但是无论医疗科学技术如何进步，我们似乎从来都无法根除这种疾病。不同于其它类型的疾病，肿瘤细胞有超常的适应能力，它们可以通过不断产生新的克隆型去不断适应新环境，这就导致我们始终无法通过某一种“特效药”去消灭所有的肿瘤细胞。

在21世纪之前的以肿瘤生物学为导向的科研成果被证实都无法有效的控制肿瘤生长，因为我们即使已经知道了当下肿瘤细胞的突变景观，但是却永远无法预测它们接下来会有什么样的突变。随着对肿瘤研究的不断深入，科学家发现以往的“以静制动”为主导的治疗理念对肿瘤的效果是非常有限的，应当转变理念达到“以动制动”。因此，就在对肿瘤治疗研究一筹莫展的时候，有科学家率先提出可以调动机体的免疫系统去杀伤肿瘤，即是利用免疫细胞强大的动态监视功能去控制肿瘤，达到及时发现并杀伤新的肿瘤细胞突变体，使其在可控范围内。

在众多以免疫为主导的治疗中，免疫检查点封闭治疗(ICB)的疗效是最显著的，相应的研究成果也获得了2018年诺贝尔生理或医学奖。众所周知，ICB的临床反应被认为主要是由T细胞识别新抗原所介导的，这些新抗原来源于癌症特异性突变，并呈现在主要组织相容性复合体分子(MHC)上。之前的研究主要集中在MHC-I类分子限制CD8 细胞毒性T细胞上，主要描述了人类肿瘤中T细胞的抗原特异性和转录状态。最新的研究则表明，针对MHC-II类的致癌驱动突变也在癌症患者中被发现，因此针对新抗原的CD4 T细胞也应当被重视起来，并且新抗原特异性CD4 T细胞在人类癌症免疫中发挥重要作用。

但即使是对肿瘤治疗效果较好的ICB，近些年也不断被发现有很多短板，最主要的问题之一就是在不同患者身上呈现的应答率明显不同。由于ICB治疗过程花费巨大，而且一旦没有疗效就会影响患者的有效治疗窗口，因此我们迫切需要良好的生物学标志物提前预测有哪些患者将会在ICB治疗后获益。同时，有关为何有些患者对ICB治疗无应答的主要原因，其中主要还是我们对肿瘤微环境的认识不够深入，特别是对T细胞的研究还不够透彻。于是近些年，特别是在单细胞测序技术大量的运用在肿瘤微环境的研究之后，不断有新的T细胞亚群，以及重要的功能基因被鉴定出来，其中一个就是我们今天要说的主角--CXCL13 T细胞。下面，Immugent将会通过近些年围绕CXCL13 T细胞的研究成果，系统的分析这群重要的T细胞亚群在肿瘤微环境中的作用。

一

首次提出T细胞上表达CXCL13具有重要功能

肿瘤浸润T细胞表达CXCL13首次进入科学家的视野是在2019年发表的一篇Cell上，篇名为：“Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative, Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma”。这项研究的作者通过对25个黑素瘤患者的肿瘤内免疫细胞进行了单细胞转录组和TCR测序，并且提出通过metacell算法降低单细胞测序深度浅的影响。随后，作者对所有CD8T细胞构建metacells，并进行基因表达分析，并且作者成功鉴定出了在不同T细胞亚群上一些共表达的基因模块。这些基因模块包括与细胞毒性效应功能相关（GZMH，GNLY，FGFBP2和CX3CR1），或者与功能失调状态相关（TIGIT，PD-1，LAG3和CXCL13）。因此，CXCL13在T细胞中的作用首次被凸显出来，并且是作为T细胞的衰竭性marker。

图1

通过相关性分析，作者证明了细胞毒性和功能失调的两个基因模块之前是呈负相关的。基于这些数据，他们计算了两个数值，一个量化功能失调基因模块的活性（基因模块锚定于LAG3），另一个评估细胞毒性基因模块表达的总体强度（基因模块锚定于FGFBP2）。然后，他们对所有CD8 metacells的“细胞毒性”数值和“功能失调“数值的分布进行比较，观察到“过渡性”CD8T细胞与功能失调的T细胞是连续分布的。相反的，细胞毒性T细胞和“过渡态” CD8T细胞之间或其与功能失调T细胞之间的连续性很弱。如下图J所示，CXCL13作为功能衰竭性相对于Naïve T细胞上调的基因再次被富集出来。

图2

在这项研究中，虽然作者发现了CXCL13在衰竭性T细胞上特异性高表达，但是由于作者的重点是在全局层面揭示影响功能衰竭性T细胞分化的因素。同时，他们的数据主要揭示了功能失调的CD8 T细胞在肿瘤微环境中处于动态分化和高度活跃的状态，而且很可能驱动着肿瘤特异性免疫应答。因此，这项研究的结果会有导向性使后续研究者将CXCL13作为T细胞衰竭性功能分子去研究，这在后续研究中被证实是不准确的。可能是metacell的算法的使用，掩盖了CXCL13 T细胞作为一个独立的亚群所存在，但是也正是因为metacell的提出，大大的提高了不同T细胞亚群间的差异基因，让研究者发现了这个重要分子。

二

CXCL13可塑造免疫活性肿瘤微环境并增强 PD-1疗效

T细胞上表达CXCL13分子再次进入研究者的视野是在2021年国人发表在JITC杂志上的一篇文章，篇名为“CXCL13 shapes immunoactive tumor microenvironment and enhances the efficacy of PD-1 checkpoint blockade in high-grade serous ovarian cancer”。临床研究表明大多数高级别浆液性卵巢癌 (HGSC) 患者对免疫检查点封锁缺乏有效反应，但是具体原因仍然有待研究。由于滤泡细胞毒性 CXCR5 CD8 T 细胞通过肿瘤中的免疫检查点阻断来恢复活力，在这项研究中作者发现肿瘤中升高的CXCL13表达表明存在更具免疫活性的微环境，并倾向于能够有效延长患者的生存时间。

图3

此外，作者发现CXCL13在体内与 CXCR5 CD8 T 细胞相邻，并在体外促进 CXCR5 CD8 T 细胞的募集和激活。CXCL13、CD8和CXCR5的组合被证实是HGSC 患者OS和PFS的独立预后因素。将 CXCL13与 PD-1阻断疗法相结合可增强抗肿瘤反应并延缓肿瘤生长，并且CXCL13 通过促进TLS 中CXCR5 CD8 T 细胞的维持来塑造抗肿瘤微环境的关键作用。因此，CXCL13和 CXCR5 CD8 T细胞可能为免疫检查点阻断治疗的潜在预后指标或反应生物标志物。

三

肿瘤抗原特异性CD4 T细胞表达CXCL13

在过去很长的一段时间内，对杀伤肿瘤T细胞的研究主要集中在MHC-I类分子限制性的CD8 细胞毒性T细胞上，前期的结果也主要描述了人类肿瘤中CD8 T细胞的抗原特异性和转录状态。今年发表在Cancer cell 杂志上的一篇名为：Neoantigen-specific CD4 T cells in human melanoma have diverse differentiation states and correlate with CD8 T cell, macrophage, and B cell function，则是针对新抗原的CD4 T细胞，包括MHC-II类的致癌驱动突变，也在癌症患者中被发现。在这项研究中作者发现，新抗原特异性CD4 T细胞在人类癌症免疫中发挥重要作用，而且CXCL13是作为这群T细胞的标志性marker。

图4

为了更准确的揭示不同肿瘤浸润CD4 T细胞亚群的功能，作者使用流式分选出CD3 CD4 T细胞，并进行了scRNA和TRC VDJ重排测序。通过严格的数据筛选后，共有10186个肿瘤浸润性CD4 T细胞被保留，随后的无监督聚类得到6个细胞群，包括1个FOXP3 Treg（cluster 0），3个PD-1 CXCL13 经典T细胞(cluster 2，3，5)，以及2个IL7Rhigh CXCL13- TCONV（cluster1，4）。其中，作者共鉴定出259个细胞，平均每个患者17-146个细胞，会表达40种新抗原特异性的TCR克隆型。值得注意的是，CXCL13 T簇中含有97%的新抗原特异的T细胞和99%的自体抗原特异性T细胞，而9个病毒特异性T细胞都在CXCL13-T细胞中，4例患者中有3例共91个细胞均显示CXCL13特异性高表达。在这4例患者中，总共有8.8%的CXCL13 PD-1high肿瘤浸润CD4 细胞亚群表达了经鉴定为肿瘤特异性的TCR。

在20例黑色素瘤患者的队列中，作者发现CXCL13 CD4 T细胞和CD8 T细胞相关，尤其是更紧密地与CXCL13 CD8 T细胞和增殖TYMS CXCL13 CD8 T细胞相关。同时，使用CXCL13、BTLA和IL21的表达作为CXCL13 CD4 T细胞的替代，对TCGA数据进行了分析。这些标记物均与黑色素瘤中CD8A的表达相关。总之，具有肿瘤抗原特异性的CD4 T细胞的比例与CD8 T细胞的浸润和活化有关，这与CD4 T细胞为肿瘤抗原特异性CD8 T细胞提供辅助功能是一致的。

图5

为了证实CXCL13 CD4 T细胞是普遍存在的，作者分析了另一套来源于接受ICB治疗的乳腺癌单细胞数据。通过分析已经发表的乳腺癌数据，作者发现类似的CD4 T细胞群体同样存在于乳腺癌患者中，在这套数据作者同样证实CXCL13 CD4 T细胞的比例与TME的CD8 T细胞、髓系细胞和B细胞组分的激活相关。最后，在TCGA中广泛观察癌症类型，CXCL13表达归一化到CD4表达中位数以上与皮肤黑色素瘤、乳腺癌和头颈癌总生存率较高相关，但在胶质母细胞瘤、葡萄膜黑色素瘤、乳头状和透明细胞肾癌中生存率较差相关。因此，泛癌分析的结果表明CXCL13可能在不同的肿瘤环境中可能呈现不同的功能，其实际上可能和CXCL13 CD4 T细胞调节的细胞功能相关。

四

CXCL13 T细胞与树突状细胞的相互作用决定免疫治疗效果

同样是今年，在Nature Cancer杂志上发表了另一篇一篇名为“The interaction of CD4 helper T cells with dendritic cells shapes the tumor microenvironment and immune checkpoint blockade response”的文章，首次证实了CXCL13 T细胞可以通过和树突细胞（DC）相互作用来发挥重要的抗肿瘤功能。这项研究的作者通过单细胞测序技术对人非小细胞肺癌进行分析，详细描述了CXCL13 CD4 T细胞与树突状细胞的相互作用，并且作者在体外和卵清蛋白特异性αβTCR CD4 T-t细胞模型中重建了它们的相互作用。最终，作者证明了Tht程序（CD4 PD-1 CXCL13 T细胞介导）由层递肿瘤抗原的DC在肿瘤淋巴结中启动，这种程序对于利用抗PD-1治疗的抗肿瘤反应非常重要。

图6

为了表征和分子分析TME中髓系细胞和T细胞之间的物理相互作用，作者将PIC-seq（这项技术的介绍见之前推文：PIC-seq：单细胞层面揭示存在物理作用的细胞互作）技术应用于早期非小细胞肺癌(NSCLC)病变的临床样本进行分析。作者分析了10例患者通过手术切除的早期未接受治疗的NSCLC病变，并将肿瘤参与的病变与邻近的无肿瘤组织进行了比较，使用MetaCell创建了TME和健康组织中单细胞状态的背景模型。根据基因表达将T细胞进行分类：迁移T细胞，幼稚T细胞，增殖T细胞，CD4 激活T细胞，CD4 记忆T细胞，CD8 T细胞，CD8 细胞毒性T和CD8 功能失调T细胞。随后，作者同样根据VCAN或CD31基因将骨髓细胞分为单核细胞的两个子集，并且将其他髓系亚群分类为四组树突状细胞：表达DC的单核细胞基因、经典DCI型树突状细胞、经典DCII型细胞和富含免疫调节分子的成熟树突状细胞。作者发现肿瘤组织和邻近无肿瘤组织之间的细胞组成存在一致的差异，他们计算了每个标本的TME与健康细胞状态的比率，并量化了子集丰度之间的相关性。结果与之前对NSCLC病变的的单细胞分析一致，因此这个结果可以作为研究TME中定义细胞相互作用的分子程序的基线。

图7

紧接着，为了更好地了解mTht细胞在体内的时空分化动态，作者利用小鼠模型，将B16-OVA细胞移植到WTC57BL/6J受体中。在肿瘤注射后10天和17天，对从肿瘤引流淋巴结(tdLNs)和颈部周围淋巴结(cLNs)中分离的12154个阳性单TCRβ T细胞进行MARS-seq检测，结果发现，抗原特异性的CD45.1 TCRβ OT-IIT细胞上调了从体外研究中衍生的mTht细胞特征、tdLNCD45.1 TCRβ OT-IIT细胞上调了T细胞激活特征、体内mTht细胞特征与幼稚t细胞基因的表达减少相关，并与细胞周期基因的表达相关。接下来，作者探讨了mTht细胞的细胞动力学及其从tdln向TME迁移的可能性。他们收集并分析了内源性TCRβ T细胞，并在第10和17天从TME过继转移OT-II CD45.1 TCRβ T细胞，以及在肿瘤注射后第10天从tdLNs和clns的细胞。结果表明，与肿瘤浸润的T细胞上调mtht相关的激活程序。

总的来说，这项研究的作者利用PIC-seq系统地描述了CD4 T细胞与树突细胞的相互作用对肿瘤微环境的影响，并发现PD-1 CXCL13 CD4 T细胞是人非小细胞肺癌肿瘤微环境中与抗原提呈细胞的主要相互作用枢纽。并且作者通过体外模型验证了这个相互作用中枢的功能对于利用抗PD-1治疗的抗肿瘤反应非常重要，这些研究结果提示我们可以通过对Tht-树突状细胞相互作用检查点的调节来进行免疫治疗。

五

肿瘤特异的CXCL13 T细胞可预测免疫治疗疗效

如果说上面几项研究是从不同的角度去揭示CXCL13 T细胞在肿瘤微环境中的作用，都得到了一定的研究成果。那么真正意义上把CXCL13 T细胞推广出去的是张泽民老师课题组在今年发表的一篇纯生信的Nature cancer上的这篇文章，篇名为：Single-cell meta-analyses reveal responses of tumor-reactive CXCL13 T cells to immune-checkpoint blockade。在这项研究中，作者分别对已发表的9个免疫治疗单细胞数据集，其中包括来自102个病人治疗前后的205个肿瘤样本，涵盖5种癌症类型（NSCLC, BCC, SCC, breast cancer 和 RCC）进行联合分析。最终，作者基于CXCL1的表达鉴定出了这些数据集中的肿瘤特异CD8 T细胞，发现肿瘤特异性CXCL13 CD8 T细胞显著富集在对ICB有响应的肿瘤中，并且在有效地治疗后显著增加，表明了肿瘤特异性CXCL13 CD8 T细胞在治疗过程中发挥关键作用，且在治疗前的浸润程度可以预测ICB的疗效。

图8

通过对肿瘤特异性CXCL13 CD8 T细胞进行聚类分析，作者鉴定了前体肿瘤特异性CXCL13 CD8 T细胞（包括IL7R HAVCR2-以及GZMK HAVCR2-两个亚型）以及耗竭信号较强的终末分化肿瘤特异T细胞，并且发现肿瘤特异性CXCL13 CD8 T细胞不同分化状态亚型在表观特征上是稳定的。此外，作者还发现了在不同癌症类型中以及治疗策略不同时（例如是否与化疗联用），治疗引起增加的肿瘤特异T细胞的亚类是不一样的。当肿瘤微环境整体免疫抑制强度较高时，ICB不足以维持前体肿瘤特异性CXCL13 CD8 T细胞的状态，观察到终末分化的肿瘤特异T细胞增加，但治疗仍然有效。当肿瘤微环境整体免疫抑制强度较低时，ICB有效阻断了肿瘤特异性CXCL13 CD8 T细胞前体细胞向耗竭程度较高的终末状态的分化。

图9

通过这项研究，作者不仅为分析肿瘤中的肿瘤特异T细胞提供了新的思路，为预测ICB疗效提供了更加准确的生物标志物；而且，还设计以TCR-T为代表的细胞疗法提供了新的策略，即通过CXCL13表达水平鉴定肿瘤中不同分化阶段的肿瘤特异T细胞克隆并设计后续临床试验；最后，为进一步提高ICB疗效提供了新的见解，即通过ICB与其他疗法联合治疗进一步缓解肿瘤微环境中的免疫抑制强度，维持前体肿瘤特异性CXCL13 CD8 T细胞状态并阻断其向终末状态分化，进而继续提高治疗效果。

六

展望

通过对上面几篇有关CXCL13 T细胞高分文章的联合解读，我们仅仅是对这种T细胞亚群有了一个大致的了解，它的具体功能仍然有很多不清楚的地方。比如，CXCL13分子最初被提出时是作为T细胞功能衰竭的marker（Cell,2019），而随后就被发现可以被用作免疫治疗应答与否的标志物（JITC, 2021）；紧接着，今年的几篇研究都将CXCL13 的CD4 T细胞作为肿瘤抗原特异性的T细胞（Cancer cell），以及在多种肿瘤中都可以作为免疫治疗应答的标志物（Nature cancer）。尽管看似我们已经对CXCL13 T细胞已经有一个全面的认识，事实上还有很多问题没有解决，如：哪一种转录因子或者通路调控了CXCL13 T细胞的发育分化？CXCL13 T细胞的功能靠什么维持，以及能否被逆转？这些都是未来需要解决的问题。

虽然现如今生物科技进步迅速，但癌症可能是人类最无法通过医疗技术根治的疾病之一了，无论是从肿瘤细胞本身的生物学特征出发还是从与之抗衡的人体免疫系统出发，这两条路都有很长的路程要走。其实我们不用奢求将肿瘤治愈，只需要控制其进展以达到类似于高血压这种慢性病程度即可。而要想实现这个目标我们迫切需要更全面的认识人体免疫系统，因为就像神经系统一样，免疫系统的功能十分强大，其可以通过协调各种免疫分子的细胞来达到动态监控肿瘤的作用。但想攻破人体复杂的免疫系统是非常艰难的，就拿肿瘤微环境中的T细胞来说，近5年就将有20 种不同的T细胞亚群被发现，还有其它很多复杂的免疫分子，如细胞因子，补体等。但Immugent始终坚信未来在全球免疫学家的共同努力下，我们终将会对免疫系统有一个更加清晰的认识，到那时我们就可以充分调动人体的免疫系统去控制肿瘤生长。

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