来源：小桔灯网
作者：动力彩虹🌈
微小残留疾病（MRD）检测和监测对于实体瘤患者的管理仍然是一个巨大的挑战。根据肿瘤类型和分期的不同，相当多的癌症患者在原发肿瘤切除后五年内发生转移。在ER（ ）乳腺癌症中，经过5年的辅助内分泌治疗后，乳腺癌症复发从5年到20年间持续稳定发生。这些乳腺癌症患者中，有很大一部分具有隐匿性微转移或MRD，在初始治疗后持续存在，这是随后远处转移复发的潜在来源。早期识别单个患者的MRD具有高度挑战性；为了实现这一目标，实时高灵敏度液体活检（LB）检测非常有前途，并为解决这一问题提供了巨大的潜力。
LB是一种微创方法，主要基于循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA）的分析。LB是抗击癌症的重要工具，因为它能够实时监测连续样本中的肿瘤分子图谱。CTC分析目前是管理晚期和早期癌症患者的有力工具；尤其是CTC分子表征为更好地理解转移生物学和对特定治疗的耐药机制提供了独特的潜力。在癌症的早期阶段，CTC的检出率通常很低，并且具有高度的异质性。十多年来，在CellSearch系统中进行的CTC计数已被FDA批准为预后标志物，并与早期和转移性乳腺癌、转移性前列腺癌和结直肠癌的无进展生存率（PFS）和总生存率（OS）相关。除了CTC计数外，CTC在基因表达水平上的分子表征有可能阐明转移生物学中涉及的关键信号通路，甚至改善患者管理。RT-qPCR检测乳腺癌患者CTC中CK-19转录物在辅助化疗之前、期间和之后具有预后意义。CTC中PIK3CA的检测对患者的随访具有重要的临床应用价值。研究团队已经开发出高度敏感和特异的检测方法，用于检测早期和转移性乳腺癌患者EpCAM（ ）CTC中PIK3CA热点突变（E545K，H1047R）和ESR1突变。
近日，一组来自希腊的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Comprehensive liquid biopsy analysis as a tool for the early detection of minimal residual disease in breast cancer”的文章。在这项研究中，研究团队首次基于长期随访，对13名确诊为早期乳腺癌症的患者进行了全面的液体活检分析。分析基于CTC计数、CTC表型特征和CTC在基因表达、DNA突变和DNA甲基化水平的分子监测，以及相应的cfDNA突变和甲基化水平。结果表明，全面的液体活检分析为癌症患者的治疗管理提供了有价值和重要的信息，可以在出现临床可检测的转移性疾病和疾病进展之前几年揭示MRD的存在。
图片来源：Scientific reports
主要内容
一
CK-19 mRNA表达
在随访期间的不同时间点，评估了所有患者样本中CK-19转录物的存在（如下图）。在十年的随访中，十名患者未出现疾病进展，其中八名（8/10，80%）患者在所有时间点均未检测到CK-19转录物。另外两名患者（Pt#3、Pt#6）在1或2个时间点被发现CK-19转录物阳性。随访期间未出现疾病进展的所有10名患者中，仅在3/135（2.2%）个测试时间点检测到CK-19转录物。
相反，两名患者（Pt#11、Pt#13）在初始诊断后几年以及PD确诊和转移诊断前，CK-19转录本拷贝数显著增加。结果表明，在辅助治疗之前、期间和之后，在可手术乳腺癌症患者的外周血中检测CK-19（ ）mRNA细胞是一个独立的预后因素，与疾病复发风险增加和生存期缩短相关。研究还表明，化疗完成后CK-19（ ）CTC的存在与晚期复发风险增加和转移性乳腺癌生存率低相关。
EpCAM（ ）CTC组分对CK-19 mRNA表达的分子分析。
图片来源：Scientific reports
二
DNA突变的检测
研究团队进一步分析了三名发生转移的乳腺癌症患者（Pt#11、Pt#12、Pt#13）血浆cfDNA和CTC-来源gDNA样本（如下图）。在所有测试时间点，发现Pt#12血浆ctDNA中ESR1突变均为阴性；该患者经历了内分泌治疗的临床客观反应，自诊断后61个月内，在分析时没有疾病进展。Pt#13在血浆ctDNA中ESR1突变呈阳性（如下图）。这名患者后来对内分泌治疗产生了耐药性。同时，PIK3CA突变分析结果表明，部分gDNA样品中PIK3CA热点突变呈阳性，为患者靶向治疗有着指导意义。
先前接受他莫昔芬或aromatase抑制剂治疗的患者中发现了ESR1突变，揭示了长期芳香化酶抑制治疗与ESR1突变的存在之间的可能相关性。获得性ESR1突变是芳香化酶抑制剂耐药性的主要机制。
P#11、P#12和P#13的CK-19、DNA突变、CTC计数和ctDNA的分子分析。图片来源：Scientific reports
三
Pt#13的综合液体活检分析
研究团队对Pt#13进行了综合液体活检分析。
CTC计数、表征和治疗干预：在随访期间，使用CellSearch系统在常规时间点进行CTC计数（如下图）。Pt#13CTC计数显示，即使在全身化疗开始之前，该患者的预后也很差，这是基于CTC数量相对较高。辅助化疗/放疗结束后，CTC数量都会有明显降低。根据CTC的表型表征进行一系列靶向治疗，CTC的绝对数量明显减少。在肝脏转移被组织学证实之前，患者的CTC持续阳性；CTC计数的急剧增加清楚地表明，在转移的影像学记录之前至少四年，疾病进展。
CTC计数结果（红星表示疾病进展的时间）。
图片来源：Scientific reports
“
CTC和相应ctDNA的分子分析
CK-19 mRNA表达：在开始辅助化疗之前，在Pt#13的PB中未检测到CK-19转录物。患者肝脏转移确诊前8个月时，PB中观察到CK-19转录物。在疾病的转移阶段，所有CK-19转录物分析样本均为阳性。
DNA突变：转移的临床表现前一年，PIK3CA热点突变和ESR1突变在来自CellSearch的CTC来源DNA中，和在血浆cfDNA和EpCAM（ ）CTC组分中连续检测到。在同一时间段，ESR1甲基化在血浆cfDNA和相应的EpCAM（ ）CTC组分中检测到。这些结果表明，虽然CTC计数的增加表明转移扩散很早，但DNA水平上的CTC分子特征清楚地表明肿瘤已经对治疗产生了耐药性。
ESR1甲基化： 从EpCAM（ ）细胞提取的SB处理的gDNA样品中，8/10（80%）检测到ESR1甲基化。在所有成对的血浆ctDNA样本中，8/10（80%）例检测到ESR1甲基化，与相应的EpCAM（ ）细胞结果显著一致。
CTC和ctDNA的分子分析结果。图片来源：Scientific reports
四
总结和讨论
研究团队对13例早期可手术乳腺癌症患者的外周血进行了为期十年的多个时间点的全面液体活检分析，包括：（a）使用CellSearch系统进行CTC计数，（b）使用免疫荧光对CTC进行表型分析，（c）基因表达分析，在EpCAM（ ）CTC中检测CK-19、CD24、CD44、ALDH1和TWIST1，（d）EpCAM（ ）CTC和相应血浆ctDNA中PIK3CA和ESR1突变的分析，以及（e）CTC中ESR1的DNA甲基化。在整个随访期间，10/13（77%）患者发现外周血中的LB标记物呈阴性，这些患者在随访期间没有复发。然而，3/13（18%）的至少一种LB标志物阳性患者在随访期内复发。即使同一患者在不同的时间点，CTC的分子特征也有很大的差异，并且在临床复发之前总是增加。结果表明，液体活检可以在临床上可检测到的转移性疾病出现之前至少4年发现MRD的存在，这表明全面的液体活检分析为乳腺癌症患者的治疗管理提供了非常重要的信息。
这是首次报道基于全面液体活检分析早期发现乳腺癌MRD和可手术乳腺癌症患者十年随访的研究。根据结果，CTC分析为这些患者的管理提供了非常重要的信息。CTC计数在一开始就表明这些患者是否具有极高的转移扩散风险。结果表明，全面的液体活检分析为乳腺癌症患者的治疗管理提供了非常重要的信息，并可以指导肿瘤学家基于精确医学选择分子靶向治疗。到目前为止，使用CTC指导全身治疗仍然存在争议，并且没有确切的数据支持其临床应用。然而，许多基于液体活检的临床试验正在进行，预计将证明CTCs的临床应用。研究团队的结果表明，全面的液体活检分析可以在临床上可检测到的转移性疾病出现四年前发现MRD的存在。为了改变癌症患者的临床实践，迫切需要基于全面液体活检分析的介入性临床试验。
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