原文出处：Cheng C, Geng F, Li Z, Zhong Y, Wang H, Cheng X, Zhao Y, Mo X, Horbinski C, Duan W, Chakravarti A, Cheng X, Guo D. Ammonia stimulates SCAP/Insig dissociation and SREBP-1 activation to promote lipogenesis and tumour growth. Nat Metab. 2022 May;4(5):575-588. doi: 10.1038/s42255-022-00568-y. Epub 2022 May 9. PMID: 35534729; PMCID: PMC9177652.
研究背景：
脂质是构成质膜和所有细胞器膜的基本结构，因此获得足够的脂质是细胞生长和增殖的先决条件。在生理条件下，脂质水平主要由固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs)调控。SREBPs是一个转录因子家族，包括SREBP-1a、-1c和-2三种亚型。SREBP-1c主要调控脂肪酸合成基因的表达，而SREBP-2调控胆固醇合成和摄取，SREBP-1a具有最高的转录活性，调控所有过程。然而，SREBP-1在癌细胞中激活和脂质代谢的调控机制仍不清楚。
SREBP作为非活性前体(125 kD)被合成并保留在内质网(ER)膜中，并通过严格控制的内质网-高尔基体-细胞核过程被激活。SREBP与SCAP结合，然后被囊泡COPII包被并结合，将SCAP/ SREBP复合物从ER转运到高尔基。在高尔基体中，SREBP被site-1和-2蛋白酶依次切割，释放其n末端形式(约65kd)，然后进入细胞核激活脂肪生成基因表达。然而，SCAP/SREBP复合物的转运被驻留在内质网的蛋白Insig所抑制，该蛋白包括两个亚型，insg -1和-2。Insig与SCAP结合，保留SCAP/SREBP复合物在ER中。先前的研究表明，胆固醇或25-羟基胆固醇(25-HC)可以与SCAP或Insig结合，以增强它们的连接，从而介导一个负反馈回路，调节SREBP的激活。然而，激活SCAP从Insig中分离以实现后续易位的关键步骤尚不清楚。
在本研究中，作者的研究进一步表明，靶向谷氨酰胺与糖脂代谢之间的关键分子链接是治疗恶性肿瘤和代谢综合征的一种有前景的策略。
研究结果：
结果一：SREBP激活和脂肪生成与谷氨酰胺密切相关
除了葡萄糖，癌细胞还消耗大量的谷氨酰胺，这是人类血液中最丰富的氨基酸，并需要大量的脂肪生成来促进肿瘤的生长。谷氨酰胺、葡萄糖和脂质合成之间是否存在内在的分子联系尚不清楚。为了验证这一点，作者首先在肺癌H1299细胞中使用RNA测序进行了转录组分析。作者发现谷氨酰胺和葡萄糖都不能单独激活调节脂肪酸和胆固醇合成和摄取的基因的表达，包括SREBF1、SREBF2、ACLY、ACACA、FASN、SCD1、HMGCR和LDLR。但值得注意的是，脂肪生成基因的激活需要谷氨酰胺和葡萄糖的同时存在，但SCAP基因的表达既不受谷氨酰胺也不受葡萄糖的影响(图1a)，这些结果可以通过PCR的验证(图1b)。接下来，作者使用多种癌细胞系研究了是否需要谷氨酰胺来激活SREBP。Western blot分析显示，单独使用葡萄糖不能激活SREBP-1和SREBP-2的裂解(图1c)。SREBP-1的两个关键下游靶点脂肪酸合成酶(FASN)和硬脂酰辅酶a去饱和酶-1 (SCD1)的表达也不能被葡萄糖单独激活(图1c)。只有谷氨酰胺和葡萄糖联合作用才能强烈诱导SREBP-1和-2的裂解，以及其N-或c -末端产物显著增加，FASN和SCD1表达上调(图1c)。接下来，作者想要探究谷氨酰胺的缺乏是否通过影响SCAP蛋白的稳定性，从而导致SREBPs失活。western blot分析，细胞核提取物中的SREBP-1 的n端表明，葡萄糖缺失导致SCAP降解和SREBP-1裂解失活(图1d)。与谷氨酰胺和葡萄糖同时存在时相比，当有葡萄糖存在时，去除谷氨酰胺对SCAP蛋白水平没有影响(图1d);然而，让人感兴趣的是，在谷氨酰胺缺失的情况下，作者无法在核提取物中检测到任何活性的n端SREBP-1(图1d)。免疫荧光染色证实，除非谷氨酰胺和葡萄糖同时存在，否则SREBP-1无法移动到核中(图1e)。作者还检测了表达GFP-SCAP的HEK293T细胞在相同的培养条件下的SCAP n -糖基化。数据显示，在葡萄糖存在的情况下，去除谷氨酰胺对SCAP n -糖基化没有影响(图1f)，以及GFP-SCAP蛋白水平也一样(图1f)。总之，这些数据表明，只有葡萄糖可以介导的SCAP n -糖基化和SCAP的稳定性，但葡萄糖不能单独激活SREBPs和在谷氨酰胺存在时的脂肪生成，这表明存在一个重要的内在分子链接，将谷氨酰胺和葡萄糖与脂质代谢联系起来。
结果二：谷氨酰胺释放的氨激活SREBPs和脂肪生成
众所周知，谷氨酰胺分解在许多癌症中都是高度激活的。在这个过程中，谷氨酰胺首先被谷氨酰胺酶(GLS)脱氨释放氨(NH3)，并产生谷氨酸。谷氨酸进一步转化为α-酮戊二酸(α-KG)，进入三羧酸(TCA)循环以产生能量。通过Bioprofile 100 Plus Analyzer，检测了H1299和U87细胞在无糖有谷氨酰胺存在下培养的培养基，作者检测到NH3(在水溶液中转化为NH4 )和谷氨酸。NH3和NH4 被称为氨。相比之下，当细胞在葡萄糖存在但不含谷氨酰胺的条件下培养时，检测到乳酸盐和谷氨酸盐(图2a)。谷氨酰胺与葡萄糖结合时，检测到NH4 /谷氨酸/乳酸三种代谢物(图2a)。然后作者检查了哪些代谢产物参与了SREBP的激活。Western blot分析显示，谷氨酸、氨(来自于添加的NH4Cl)或乳酸均不能单独激活SREBP-1或-2的切割以及促进FASN和SCD1的表达(图2b)。相反，在葡萄糖存在下，氨诱导SREBP-1和-2分裂，以及FASN和SCD1的表达，与谷氨酰胺和葡萄糖联合作用的程度相似(图2b)。添加的NH4Cl溶液的作用是剂量和时间依赖性的(图2c, d)。免疫荧光成像进一步显示，在葡萄糖存在的情况下，氨显著刺激SREBP-1易位进入细胞核(图2e)。H1299细胞的RNA测序分析证实，氨与谷氨酰胺类似，与葡萄糖相比，氨显著激活了控制脂肪酸和胆固醇合成通路的基因的表达(图2f)，实时PCR进一步证实的一致（图2g)。作者进一步研究了氨是否影响了葡萄糖调节的SCAP的稳定性和n -糖基化。Western blot分析显示，与葡萄糖单独作用相比，在葡萄糖存在下，氨对SCAP蛋白和n -糖基化水平均无影响(图2h, i)，但氨显著激活SREBP-1和-2的裂解并增加FASN和SCD1表达(图2h)。总之，这些数据表明，谷氨酰胺释放的氨是SREBP激活和脂肪生成的关键激活因子。
结果三：抑制谷氨酰胺的分解会抑制SREBP的激活
接下来，作者验证了谷氨酰胺释放的氨在刺激SREBP激活和脂肪生成中的作用。作者用γ-谷氨酰对硝基苯胺(GPNA)抑制谷氨酰胺摄取（它是一种主要的谷氨酰胺转运体SLC1A5(也称为ASCT2)的抑制剂)并用CB-839（一种谷氨酰胺酶(GLS)抑制剂）阻断谷氨酰胺分解。代谢物分析显示，GPNA和CB-839处理均显著降低了细胞和细胞培养液中谷氨酸、氨和α-KG的水平(图3a)。这两种抑制剂都能显著抑制谷氨酰胺刺激的SREBP激活和FASN和SCD1的表达(图3b)。然后，作者在细胞中添加氨(添加NH4Cl的溶液)、谷氨酸或α-KG，以确定哪种代谢物能够恢复CB-839抑制的SREBP激活。Western blot分析显示，只有添加氨(添加NH4Cl的溶液)的组能明显恢复SREBP激活和FASN/SCD1表达(图3c)。免疫荧光成像显示，CB-839阻断了SREBP-1的细胞核易位，通过添加氨可以成功恢复，但加入谷氨酸无法修复(图3d)。作者还利用慢病毒介导的shRNA抑制GLS，以从遗传学抑制谷氨酰胺的氨释放。GLS敲低显著降低谷氨酰胺消耗，抑制谷氨酸、氨和α-KG的生产(图3e)，并明显抑制SREBP的激活和FASN/SCD1的表达(图3f)。补充氨，而不是谷氨酸或α-KG，显著恢复了SREBP的激活和FASN ，SCD1的表达(图3g)。SREBP-1核易位的免疫荧光成像也可以证实(图3h)。GLS 的药理学和遗传抑制也明显减少了核提取物中 SREBP-1 N 末端形式的出现（图 3i），而它们没有改变 SCAP 蛋白和 N-糖基化水平（图 3i-k）。这些数据证实，氨从谷氨酰胺释放激活SREBP和脂肪生成，揭示了通过谷氨酰胺- GLS -氨- SREBP激活轴，谷氨酰胺分解和脂肪生成连接在一起。
结果四：人类肿瘤中，GLS和SREBP-1有高度相关性
接下来作者检查谷氨酰胺分解和脂肪生成之间的联系是否可以在人体中得到验证。作者首先用western blot方法分析了7对配对的肿瘤与相邻的正常人类肺组织，这些组织来自于腺癌、鳞状和大细胞肺癌患者。数据显示，与相邻的正常肺组织相比，7个肿瘤组织均高水平表达GLS, SREBP-1，切割后的N-SREBP，而且FASN蛋白显著增加(图4a)。然后作者检查了多个石蜡包埋的肿瘤与相邻的正常肺组织，免疫组化染色显示，肿瘤组织(T)中GLS的表达以及胞质和核SREBP-1的染色程度明显升高，而相邻正常组织(N)中两者的染色均较低(图4b)。然后，作者用氨检测试剂盒测量10对肺组织的氨水平。与GLS表达和SREBP-1激活的升高一致(图4a, b)，数据显示肿瘤中氨水平显著高于配对正常组织(图4c)。接下来，作者检测了一个包含99个肿瘤和50个匹配的相邻正常肺组织的组织芯片(TMA)，这些组织来自不同类型的肺癌患者。免疫组化染色显示，与相邻正常肺组织相比，90%以上的肺肿瘤组织中GLS的水平较高，而且SREBP-1染色较明显(图4d, e)。Pearson相关性分析显示，GLS的表达与SREBP-1的染色程度密切相关(图f)。作者还检查了多个GBM组织和91个神经胶质瘤样本的TMA。免疫组化染色显示，在低至高级别胶质瘤的肿瘤组织中，GLS高表达和SREBP-1强染色是相关的(图4g-j)。Kaplan-Meier图分析进一步显示，GLS表达更高和SREBP-1染色更强伴随着GBM患者生存更差(图4k)。总之，这些大型临床样本分析表明，在人类癌症中，GLS表达与SREBP-1激活显著相关，为生理条件下谷氨酰胺分解和脂肪生成之间的分子联系提供了强有力的证据。
结果五：氨结合SCAP，并将其从Insig中分离出来
由于谷氨酰胺和氨都不影响SCAP的稳定性和n -糖基化(见图1d、f和图2h、i)，作者想知道它们是否参与了SCAP/Insig的解离，从而促进SREBP的激活(图5a)。作者在HEK293T细胞中共转染GFP-SCAP和Myc标记的Insig-1 (Myc-Insig-1)，然后在葡萄糖存在下用谷氨酰胺或氨(NH4Cl)培养这些细胞。联合免疫沉淀(co-IP)试验和western blot分析显示，与单独使用葡萄糖相比，谷氨酰胺或氨大幅度降低了SCAP和Insig-1的相关性(图5b)。共聚焦显微镜成像显示谷氨酰胺或氨刺激GFP-SCAP转移到高尔基体（GFP-SCAP与Giantin(红色)共定位，Giantin是一种高尔基体蛋白标记物）(图5c)。相比之下，CB-839抑制GLS则完全恢复了SCAP与Insig-1的结合，如图co-IP所示(图5d)。共聚焦显微镜成像进一步显示，GLS的抑制消除了谷氨酰胺促进的GFP-SCAP向高尔基体的转运，而通过添加氨则可以完全恢复了这一转运(图5e)，表明谷氨酰胺释放的氨刺激SCAP从Insig解离，从而触发其转运。为了阐明氨与SCAP的相互作用，作者利用SCAP/Insig跨膜域的低温电镜，以及利用共溶剂分子动力学(MD)模拟来绘制SCAP中潜在的氨结合位点。有趣的是，当25-HC缺失时，NH4 ，而不是NH3，被发现占据了靠近SCAP S6螺旋的跨膜区域的一个大球体(图5f)。作者仔细检查了这个位点，发现它是由3个关键残基形成的:来自S6螺旋的天冬氨酸D428，来自S3螺旋的丝氨酸S326和S330(图5g)。值得注意的是，D428和S326/S330是SCAP中进化高度保守的残基。NH4 在整个模拟过程中与D428、S326和S330侧链形成稳定的氢键，其亲合力为:D428 >> S330 > S326(图5g)。Western blot分析证实了这些结合预测，表明将带负电荷的天门冬氨酸转变为中性丙氨酸(D428A)，则会完全消除NH4 或谷氨酰胺对SREBP-1激活的刺激。S330A 突变体轻微降低了 SREBP-1 的激活，而 S326A/S330A 双突变体则明显降低了它（图 5h）。相比之下，当缬氨酸 353(从S4螺旋)突变为甘氨酸(V353G)时，SREBP-1的激活没有影响(图5g, h)。作者在从细胞膜纯化这些蛋白后，比较了氨结合GFP-SCAP野生型(wt)和其D428A突变体(图5i, j)。结果表明，氨结合GFP-SCAP野生型(wt)的水平比对照GFP蛋白高约2倍，而D428A突变体则抑制了结合，使氨结合水平恢复到对照GFP蛋白的水平(图5j)。接下来，作者研究了D428A突变是否可以消除谷氨酰胺和氨引起的SCAP从Insig的分离。Co-IP数据显示，D428A突变破坏了谷氨酰胺和氨介导的SCAP从Insig-1的解离激活(图5k)。因此，谷氨酰胺或氨刺激的GFP-SCAP向高尔基体的转移也被D428A突变所抑制(图5l)。此外，与野生型SCAP转染相比，D428A突变阻断了谷氨酰胺和氨促进的SREBP-1a、-1c和-2的激活(图5m)，突出了D428对氨刺激的重要性。总之，氨通过与D428、S326和S330残基的相互作用，诱导SCAP跨膜结构域的构象变化，从而刺激SCAP从Insig中分离，最终导致SCAP/SREBP易位和活化。D428A 突变抑制了氨与 SCAP 的结合，因此即使在低甾醇条件下也能保持与 Insig 的结合。
结果六：破坏氨- SCAP相互作用可以抑制肿瘤的生长
接下来，作者通过将SCAP中的D428转化为丙氨酸(D428A)来干扰氨与SCAP的相互作用是否会影响肿瘤的生长。将GFP、GFP- SCAP野生型或D428A突变体转染到稳定表达荧光素酶的H1299肺癌细胞中。Western blot分析显示，野生型SCAP显著增加了SREBP-1和SREBP -2的切割及成熟，而D428A突变则抑制了这种切割(图6a)。这些稳定转染的细胞被植入小鼠体内。与对照组GFP组相比，GFP- SCAP野生型植入后50天，发现显著增加了肺区域的肿瘤生长，而D428A突变消除了这种增长(图6b, c)。肺大体图像显示，GFP- SCAP野生型组肺表面的肿瘤病变数量高于GFP和D428A突变组(图6d)。H&E染色证实，GFP- SCAP野生型组肺部肿瘤病变数量显著增加(图6d, e,)。免疫组化染色显示，与GFP组相比，GFP- SCAP野生型组肺肿瘤组织中SREBP-1水平显著升高，而这种升高会被D428A的突变消除掉(图6d, e)。作者用原代GBM30细胞重复这些实验(图6f) 。将稳定转染的GBM细胞植入小鼠大脑，通过磁共振成像(MRI)检测肿瘤生长情况。影像学显示，GFP- SCAP野生型组的肿瘤体积显著大于对照组GFP和D428A突变组(图6g)。H&E染色证实各组第17天的肿瘤大小与MRI检查结果一致(图6h)。免疫组化染色显示，GFP- SCAP野生型组的SREBP-1染色明显强于其他两组(图6h, i)。此外，植入GFP- SCAP野生型表达细胞的小鼠的生存时间明显短于其他两组(图6j)。总之，这些数据表明，通过突变D428残基来破坏氨与scap的相互作用，可以显著抑制SREBP-1的激活和肿瘤的生长。
研究结论：
1.SREBP的激活和脂肪的生成与谷氨酰胺密切相关，谷氨酰胺释放的氨可以激活SREBPs和脂肪生成
2.人类肿瘤中，GLS和SREBP-1有高度相关性。抑制谷氨酰胺的分解会抑制SREBP的激活
3.氨结合SCAP，并将其从Insig中分离出来
4.破坏氨- SCAP相互作用可以抑制肿瘤的生长
校对：王钰雄
联系客服
