Chestnut Studying
摘要
High circulating levels of lactate and high mobility group box-1 (HMGB1) are associated with the severity and mortality of sepsis. However, it is unclear whether lactate could promote HMGB1 release during sepsis. The present study demonstrated a novel role of lactate in HMGB1 lactylation and acetylation in macrophages during polymicrobial sepsis. We found that macrophages can uptake extracellular lactate via monocarboxylate transporters (MCTs) to promote HMGB1 lactylation via a p300/CBP-dependent mechanism. We also observed that lactate stimulates HMGB1 acetylation by Hippo/YAP-mediated suppression of deacetylase SIRT1 and β-arrestin2-mediated recruitment of acetylases p300/CBP to the nucleus via G protein-coupled receptor 81 (GPR81). The lactylated/acetylated HMGB1 is released from macrophages via exosome secretion which increases endothelium permeability. In vivo reduction of lactate production and/or inhibition of GPR81-mediated signaling decreases circulating exosomal HMGB1 levels and improves survival outcome in polymicrobial sepsis. Our results provide the basis for targeting lactate/lactate-associated signaling to combat sepsis.
高循环乳酸水平和高迁移率族 box-1 (HMGB1) 与脓毒症的严重程度和死亡率相关。然而，乳酸是否能促进败血症期间 HMGB1 的释放尚不清楚。本研究证明了乳酸在多种微生物脓毒症期间巨噬细胞 HMGB1 乳酸化和乙酰化中的新作用。我们发现巨噬细胞可以通过单羧酸转运蛋白 (MCT) 摄取细胞外乳酸，从而通过 p300/CBP 依赖机制促进 HMGB1 乳酸化。我们还观察到乳酸通过 Hippo/YAP 介导的脱乙酰酶 SIRT1 抑制和 β-arrestin2 介导的乙酰化酶 p300/CBP 通过 G 蛋白偶联受体 81 (GPR81) 募集至细胞核来刺激 HMGB1 乙酰化。乳酰化/乙酰化 HMGB1 通过外泌体分泌从巨噬细胞中释放出来，从而增加内皮通透性。体内乳酸产生的减少和/或 GPR81 介导的信号传导的抑制降低了循环外泌体 HMGB1 水平并改善了多种微生物败血症的存活结果。我们的结果为靶向乳酸/乳酸相关信号以对抗败血症提供了基础。
实验结果1
多种微生物脓毒症期间血清中乳酸和 HMGB1 水平升高
临床证据表明，高血清乳酸水平与脓毒症患者的活动性和死亡率有关。此外，血清 HMGB1 水平升高与脓毒症晚期死亡率呈正相关。实际上，在盲肠结扎穿刺 (CLP) 诱导的脓毒症模型中，我们观察到与假对照组相比，CLP 脓毒症小鼠的血清乳酸（图 1A）和 HMGB1（图 1B）水平显着增加了 170% 和 183%。为了确定增加的乳酸水平是否可以调节脓毒症期间血清 HMGB1 的产生，作者通过 i.p. 增加了血清乳酸水平。在诱导脓毒症后 6 小时向小鼠注射乳酸，并检测血清 HMGB1 和乳酸水平。如图所示。如图 1A 和 B 所示，在假手术对照小鼠中，乳酸给药略微增加了血清乳酸和 HMGB1 水平。值得注意的是，与脓毒症小鼠相比，对脓毒症小鼠给予乳酸可使血清乳酸水平显着增加 44%（图 1A），HMGB1 水平显着增加 63%（图 1B），而脓毒症小鼠的存活率降低（图 1C）。相反，草酸钠（一种特定的 LDH 抑制剂）抑制乳酸的产生，显着减弱了 CLP 脓毒症增加的 HMGB1（图 1D）和乳酸（图 1A）血清水平，从而改善了脓毒症小鼠的生存结果（图 1C）。这些数据表明，乳酸在脓毒症升高的血清 HMGB1 水平和死亡率中起着重要作用。
实验结果2
血清外泌体在多种微生物脓毒症中含有高水平的 HMGB1
HMGB1 在脓毒症细胞外释放时在多器官功能障碍中发挥关键作用。外泌体已被证明可以介导细胞、组织和器官之间的串扰。为了检查脓毒症期间 HMGB1 是否可以通过循环外泌体携带，作者从用或不用补充乳酸处理的假对照和脓毒症小鼠中收集了血液样本，并通过 ELISA 测量了有和没有外泌体耗尽的血清中的 HMGB1 水平。图 1E 显示，与假对照相比，CLP 脓毒症显着增加了 HMGB1 的血清水平。向脓毒症小鼠补充乳酸进一步增加了血清 HMGB1 水平（图 1E），这与图 1B 中显示的数据一致。然而，在去除血清外泌体后，假手术、CLP 脓毒症、Lac 假手术和 Lac CLP 脓毒症中的血清 HMGB1 水平分别显着降低了 36.8%、49.3%、48.2% 和 44.0%（图 1E）。数据表明循环外泌体含有大量 HMGB1。
接下来，作者关注外泌体 HMGB1 在脓毒症期间的作用。并发现，与假对照相比，CLP 败血症显着增加了血清外泌体中的 HMGB1 水平（图 1F）。通过动态光散射分析测量分离的血清外泌体的大小（125.02 ± 24.6），外泌体进一步表征为存在外泌体标记物和不存在内质网（ER）蛋白钙连接蛋白。重要的是，与脓毒症对照小鼠相比，通过向脓毒症小鼠施用乳酸来提高血清乳酸水平可使外泌体 HMGB1 水平进一步增加 180%（图 1F）。相反，草酸盐对乳酸产生的抑制显着抑制了败血症增加的外泌体 HMGB1 产生（图 1G）。总之，这些数据表明脓毒症会增加血清外泌体 HMGB1 水平，并且乳酸在外泌体介导的 HMGB1 释放中发挥调节作用。
实验结果3
乳酸通过巨噬细胞中的外泌体分泌增加 HMGB1 细胞质积累和释放
先前的研究表明，活化的巨噬细胞是炎症期间分泌的 HMGB1 的主要来源之一。一致地，作者观察到 LPS 强烈促进巨噬细胞中 HMGB1 从细胞核转移到细胞质（图 2A）。乳酸给药进一步促进 HMGB1 在 LPS 刺激的巨噬细胞中的细胞质定位（图 2A），而草酸盐抑制内源性乳酸的产生减弱了 LPS 诱导的 HMGB1 在巨噬细胞中的细胞质积累（图 2B）。为了进一步探索乳酸在巨噬细胞 HMGB1 分泌中的调节作用，作者随后用乳酸 (10mM) 处理巨噬细胞并观察到单独的乳酸可以强烈诱导 HMGB1 在巨噬细胞细胞质中的积累（图 2C）。流式细胞术分析表明，浓度高达 20mM 的乳酸对巨噬细胞没有表现出显着的有害影响，这表明乳酸增加的 HMGB1 细胞质定位不是通过诱导细胞死亡和细胞凋亡来介导的。先前的一项研究表明，胞质溶胶 HMGB1 被浓缩到分泌性溶酶体中以供随后释放。实际上，作者的免疫沉淀数据显示乳酸盐（乳酸或乳酸钠）促进了 HMGB1 和 Lamp1（一种溶酶体标记物）的共定位（图 2D）。为了进一步评估乳酸是否可以诱导外泌体中巨噬细胞释放 HMGB1，作者从乳酸刺激或对照巨噬细胞的上清液中分离出外泌体，并检测了外泌体 HMGB1 蛋白水平。如图 2E 和 F 所示，乳酸或乳酸钠显着增加了分离的外泌体中的 HMGB1 水平。这些数据表明，乳酸可以诱导 HMGB1 在细胞质中积累，并促进其定位于溶酶体，随后通过外泌体分泌释放。
实验结果4
乳酸直接促进巨噬细胞中的 HMGB1 乳酸化
Zhang 最近的一项研究表明，乳酸可直接修饰核组蛋白，该过程已被确定为赖氨酸乳酸化 (Klac) 。有趣的是，作者发现 LPS 显着提高了 HMGB1 免疫复合物中的 Klac 水平（图 3A）。为了确定乳酸是否是 LPS 诱导的 HMGB1 乳酸化的介质，作者在 LPS 刺激之前通过草酸盐抑制了内源性乳酸的产生，并观察到草酸盐强烈减弱了巨噬细胞中 LPS 诱导的 HMGB1 乳酸化（图 3A）。一致地，作者观察到来自 CLP 脓毒症小鼠的分离的腹膜巨噬细胞具有增加的乳酰化 HMGB1 水平（图 3B）。向空白小鼠和 CLP 小鼠施用乳酸盐进一步增加了腹膜巨噬细胞中的 HMGB1 乳酸化水平（图 3B）。为了进一步验证乳酸对 HMGB1 乳酸化的影响，作者用乳酸或低氧挑战处理巨噬细胞，并检查核提取物中的乳酸化水平。作者的数据显示，乳酸处理或通过缺氧挑战增加乳酸产量显着增加巨噬细胞核中的 Klac 水平。正如预期的那样，我们的免疫沉淀数据显示乳酸盐（乳酸或乳酸钠）显着增加了 HMGB1 免疫复合物中的 Klac 水平（图 3C）。免疫荧光染色还显示乳酸促进了 Klac 和 HMGB1 在 RAW 264.7 巨噬细胞细胞质中的共定位（图 3D）。
据报道，赖氨酸乙酰化酶 p300 在无细胞系统中催化乳酰基从乳酰辅酶 A 转移到组蛋白。作者研究了 p300 及其同系物 CREB 结合蛋白 C (CBP) 是否也有助于巨噬细胞中乳酸诱导的赖氨酸乳酸化。为此，作者通过 C646 抑制了 p300/CBP 乙酰化酶的活性，并观察到 p300/CBP 抑制显着降低了巨噬细胞中乳酸促进的 Klac 水平（图 3E）。为了进一步确定 p300/CBP 活性在催化 HMGB1 乳酰化中的作用，作者用抗 HMGB1 抗体进行了免疫沉淀，并检测了 HMGB1 免疫复合物中的 Klac 水平。图 3F 显示 C646 抑制 p300/CBP 的酶活性减弱了 HMGB1 免疫复合物中乳酸增加的 Klac 水平。类似地，p300 或 CBP 的特异性 siRNA 沉默也减弱了巨噬细胞中乳酸诱导的 HMGB1 乳酸化（图 3G）。总之，这些数据表明乳酸可以在 p300/CBP 依赖机制中直接诱导核 HMGB1 乳酰化，这可能是 HMGB1 从细胞核转移到细胞质的原因。
实验结果5
MCT 促进巨噬细胞摄取乳酸以进行 HMGB1 乳酸化
接下来，作者研究了巨噬细胞是否可以通过单羧酸转运蛋白 (MCT) 摄取细胞外乳酸以进行 HMGB1 乳酰化。作者通过 MCT 抑制剂 (CHC) 阻断了巨噬细胞中的细胞外乳酸摄取（图 3H），并观察到 MCT 抑制抑制了乳酸诱导的巨噬细胞中 Klac 水平的增加。重要的是，MCT 抑制抑制了乳酸诱导的 HMGB1 乳酰化，HMGB1 免疫复合物中 Klac 水平的降低证明了这一点（图 3I）。免疫荧光染色还表明，CHC 显着降低了乳酰化 HMGB1 的细胞质保留（图 3D）。此外，CHC 减弱了乳酸增加的 HMGB1 在溶酶体中的积累，HMGB1 免疫复合物中溶酶体标记物 CD63 的表达降低证明了这一点（图 3J）。此外，MCT 抑制降低了巨噬细胞来源的外泌体中乳酸诱导的 HMGB1 水平（图 3K）。总之，这些数据表明巨噬细胞可以通过 MCT 摄取细胞外乳酸，这有助于 HMGB1 乳酸化。
实验结果6
乳酸促进巨噬细胞中的 HMGB1 乙酰化
为了深入了解乳酸是否也可以促进 HMGB1 的乙酰化释放，作者在乳酸处理后通过免疫沉淀检测了 HMGB1 中的赖氨酸乙酰化 (Kac) 水平。如图 4A 所示，乳酸处理显着增加 HMGB1 免疫复合物中的 Kac，表明乳酸促进 HMGB1 赖氨酸乙酰化。使用特定的抗乙酰化 HMGB1 抗体，作者观察到在乳酸刺激后 HMGB1 中赖氨酸 12 和 29 残基的乙酰化水平增加（图 4B）。为了排除乳酸通过改变培养基酸度诱导 HMGB1 乙酰化的可能性，作者还用乳酸钠处理了巨噬细胞，发现乳酸钠也将巨噬细胞中的乙酰化水平增加到类似的程度（图 4C）。共聚焦显微镜还显示乳酸增加了乙酰化 HMGB1 的水平，其主要与巨噬细胞细胞质中的 Lamp1 阳性细胞器共定位。相反，草酸盐 (10mM) 对乳酸产生的抑制以剂量依赖性方式显着降低 HMGB1 乙酰化（图 4D）。同样，作者观察到乳酸促进 HMGB1 乙酰化和细胞质分布在骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM)（图 4E）和腹膜巨噬细胞（图 4F 和 4G）中。此外，在从脓毒症小鼠中恢复的腹膜巨噬细胞中施用乳酸进一步增加了 CLP 诱导的 HMGB1 乙酰化（图 4H）。总的来说，这些数据表明乳酸刺激 HMGB1 乙酰化并促进 HMGB1 在巨噬细胞中从细胞核易位到细胞质。
实验结果7
乳酸通过抑制脱乙酰酶 SIRT1 活性促进 HMGB1 乙酰化
为了剖析乳酸促进巨噬细胞 HMGB1 乙酰化的分子机制，作者重新分析了从 Gene Expression Omnibus (GEO) 获得的公共基因表达数据集 (GSE115354)。作者观察到，在乳酸刺激的 M1 BMDM 中，III 类赖氨酸脱乙酰酶表达下调，而赖氨酸乙酰酶表达上调。SIRT1 是一种 NAD 依赖性 III 类蛋白脱乙酰酶，据报道可调节 HMGB1 乙酰化/脱乙酰化的平衡。作者的数据显示乳酸处理显着降低巨噬细胞中细胞质和细胞核 SIRT1 的水平（图 5A），表明 SIRT1 可以参与乳酸诱导的 HMGB1 乙酰化。事实上，selisistat (EX527)（一种特定的 SIRT1 脱乙酰酶抑制剂）对 SIRT1 脱乙酰酶活性的抑制显着增加了 HMGB1 乙酰化（图 5B）。相反，SIRT1 的激活剂 SRT2183（图 5C）和腺病毒介导的 SIRT1 过表达（图 5D）对 SIRT1 的药理学激活显着降低了 HMGB1 乙酰化水平。这些数据表明，乳酸抑制 SIRT1 脱乙酰酶的表达，从而使 HMGB1 乙酰化/脱乙酰化的平衡向巨噬细胞中的乙酰化倾斜。
实验结果8
乳酸抑制的 SIRT1 表达由 YAP 失活介导
据报道，YAP 可以保留 SIRT1 的表达和激活。作为 Hippo 信号的关键组成部分，LATS 激活直接增加 YAP 磷酸化，导致 YAP 降解。一致地，作者发现乳酸处理显着增加了磷酸化-LATS1 和磷酸化-YAP 的蛋白质水平，同时降低了 RAW 264.7 巨噬细胞中细胞溶质和核 YAP 蛋白的表达（图 5E）。共聚焦显微镜检查揭示了 YAP 和 SIRT1 在对照巨噬细胞核中的共定位，这种共定位通过乳酸处理而降低。这些数据表明，乳酸可以诱导由 LATS1 激活介导的 YAP 磷酸化和降解，从而抑制 SIRT1 与 YAP 的核转位。
为了探索 YAP 在乳酸处理后调节 SIRT1 表达和 HMGB1 乙酰化中的作用，作者从野生型 (WT) 和巨噬细胞特异性 YAP 敲除小鼠（YAPfl/fl；Lyz2-Cre ）中分离腹膜巨噬细胞并检查了 SIRT1 表达和 HMGB1 乙酰化。通过流式细胞术评估分离的腹膜巨噬细胞的纯度。YAP 敲除通过免疫荧光染色和蛋白质印迹（图 5F）得到证实。作者发现 YAP 缺乏会显着降低 SIRT1 水平并增加腹膜巨噬细胞中的 HMGB1 乙酰化（图 5F）。相反，通过用表达 YAP 的腺病毒 (Ad-YAP) 转导巨噬细胞来强制 YAP 表达显着增加 SIRT1 核水平并抑制 HMGB1 乙酰化，表明需要 YAP 来维持 SIRT1 表达和核转位以实现 HMGB1 的稳态 巨噬细胞中的乙酰化/脱乙酰化。
接下来，作者通过维替泊芬 (VP) 抑制 YAP 转录活性，并检测 SIRT1 和 HMGB1 乙酰化水平的表达。正如预期的那样，VP 抑制 SIRT1 的 mRNA和蛋白质水平，同时以剂量依赖性方式增加 HMGB1 乙酰化水平，表明 YAP 在控制 SIRT1 的转录中发挥作用。利用转录因子结合位点 (TFBS) 分析工具，作者在 SIRT1 启动子区域确定了 TEAD 的潜在结合位点（图 5G）。然后，作者进行了染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定，并检查了 TEAD 在 SIRT1 启动子区域的富集情况。如图 5H 所示，巨噬细胞中 SIRT1 启动子上的 TEAD 显着富集。然而，乳酸处理显着降低了 TEAD 与 SIRT1 启动子的结合（图 5H），这与乳酸抑制的 YAP 核表达相关（图 5E）。总之，这些数据表明 YAP 激活和核转位对于 SIRT1 核转位以维持巨噬细胞中 HMGB1 乙酰化/脱乙酰化的稳态至关重要。此外，乳酸诱导的 YAP 磷酸化和降解抑制 SIRT1 转录，从而促进 HMGB1 乙酰化。
实验结果9
乳酸激活的 β-arrestin2 募集 p300/CBP 用于巨噬细胞中的 HMGB1 乙酰化
作者接下来研究了乳酸给药后赖氨酸乙酰化酶的表达，并观察到乳酸处理显着增加了 p300 的转录水平（图 6A）并增加了 p300 和 CBP 的胞质溶胶和核蛋白水平（图 6B）。共聚焦显微镜（图 6C）和免疫沉淀也显示 p300 和 CBP 之间在乳酸处理中的相互作用显着增加。值得注意的是，作者观察到乳酸增加了 HMGB1 免疫复合物中 p300 和 CBP 的水平。为了确定 p300/CBP 的乙酰化酶活性是否是乳酸诱导的 HMGB1 乙酰化所必需的，在给予乳酸之前用 C646 处理巨噬细胞。如图 6D 所示，p300/CBP 乙酰化酶活性的抑制显着减弱了乳酸诱导的胞质溶胶中乙酰化 HMGB1 水平的增加。类似地，通过 siRNA 转染沉默 p300或 CBP可部分阻断巨噬细胞中乳酸诱导的 HMGB1 乙酰化，表明乙酰化酶 p300/CBP 参与乳酸促进的 HMGB1 乙酰化。
据报道，β-抑制蛋白通过以 p300 依赖性方式增强组蛋白乙酰化，易位到细胞核中以调节基因转录。有趣的是，作者观察到乳酸特异性增加了巨噬细胞中 β-arresin2 而不是 β-arresin1（图 6E）的核表达。免疫荧光染色进一步显示，在乳酸处理的巨噬细胞中，β-arrestin2 的核转位和乙酰化 HMGB1 的细胞质积累增加。类似地，用乳酸处理 BMDMs 也增加了核 β-抑制蛋白 2 水平和乙酰化 HMGB1 的胞质溶胶水平（图 4E）。然而，在乳酸处理前通过 siRNA 转染沉默 β-arresin2 显着减弱了乳酸诱导的 p300/CBP 核积累和 HMGB1 乙酰化（图 6F）。总的来说，作者的数据表明，依赖于 β-arristin2 的 p300/CBP 募集到细胞核中在乳酸介导的 HMGB1 乙酰化中起重要作用。
实验结果10
乳酸诱导的 HMGB1 乙酰化由 GPR81 信号介导
据报道，G 蛋白偶联受体 81 (GPR81) 是介导细胞内信号转导的乳酸受体。为了研究 GPR81 在乳酸诱导的 HMGB1 乙酰化中的作用，作者在乳酸处理前 2 小时用 GPR81 拮抗剂 3-羟基丁酸 (3-OBA) 处理巨噬细胞。图 7A 显示 GPR81 抑制减弱了乳酸诱导的巨噬细胞中 β-arrestin2、p300 和 CBP 的核积累。GPR81 抑制还阻止了乳酸诱导的 LATS1 和 YAP 磷酸化，并保留了巨噬细胞中的 YAP 表达（图 7B）。重要的是，与对照组相比，阻断 GPR81 信号显着减弱了乳酸促进的 HMGB1 乙酰化（图 7C 和 7D）并抑制了乳酸增加的外泌体 HMGB1 水平（图 7E）。为了进一步证实 GPR81 信号的体内抑制是否会减弱脓毒症增加的血清外泌体 HMGB1 水平，通过 i.p. 给小鼠施用 3-OBA。分析了 CLP/假手术前注射和血清外泌体中 HMGB1 的表达。如图 7F 所示，GPR81 抑制显着降低了脓毒症小鼠血清外泌体中的 HMGB1 水平。总之，这些数据证明 GPR81 通过 β-arrestin2 介导的 p300/CBP 乙酰化酶募集和细胞核中 SIRT1 脱乙酰酶的 YAP 依赖性抑制，在乳酸促进的 HMGB1 乙酰化中发挥重要作用。
实验结果11
巨噬细胞来源的外泌体 HMGB1 诱导内皮功能障碍
循环 HMGB1 水平升高会导致内皮损伤。然而，外泌体 HMGB1 在脓毒症发病机制中的作用尚不清楚。作者观察到，源自乳酸处理的巨噬细胞的外泌体显着降低了 VE-钙粘蛋白和紧密连接蛋白 5，同时增加了 HUVEC 中 ICAM1 蛋白水平（图 8A）。
此外，来自乳酸处理的巨噬细胞的外泌体显着增加了内皮的通透性，而来自对照巨噬细胞的外泌体没有这种作用（图8B）。相比之下，在外泌体富集之前通过巨噬细胞中的特异性 siRNA 沉默 HMGB1（图 8C）可以防止外泌体 HMGB1 降低 VE-钙粘蛋白和紧密连接蛋白 5 的表达，以及内皮细胞中外泌体 HMGB1 诱导的 ICAM1 表达（图 8D）。作者已经表明，乳酸诱导的 HMGB1 释放是由 YAP 表达的下调和 p300/CBP 乙酰化酶的激活介导的。接下来，作者通过特定 siRNA 沉默 p300 或 CBP 表达，并在乳酸刺激前通过腺病毒转导在 RAW 264.7 细胞中过表达 YAP。p300 (A) 和 CBP (B) 的下调以及 YAP (C) 的上调，减弱了外泌体 HMGB1 降低的 VE-钙粘蛋白和 Claudin5 表达，以及外泌体 HMGB1 诱导的内皮细胞 ICAM1 表达 细胞。总的来说，这些数据表明乳酸促进 HMGB1 乳酸化、乙酰化和通过外泌体分泌释放。含有 HMGB1 的外泌体进一步破坏内皮粘附蛋白和紧密连接蛋白并增加粘附分子表达，导致内皮屏障功能障碍（图 8E）。
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