文章题目：
Classification of Tumor Immune Microenvironment (TIME) According to PD-L1Expression and Immune Infiltration Predicts Response to Immunotherapy plusChemotherapy in Advanced NSCLC Patients
研究背景：
近年来，基于程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)或程序性死亡配体1(PD-L1)的免疫治疗使肿瘤的治疗策略发生了革命性的变化。特别是免疫联合铂类化疗已成为晚期非小细胞肺癌(NSCLC)一线治疗的标准。
以往的研究表明，肿瘤细胞可通过多种获得性免疫抵抗(AIR)机制逃避免疫监视，包括激活PD-1/PD-L1通路和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL包括B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞和自然杀伤细胞。
根据获得性免疫抵抗的机制，肿瘤免疫微环境(TIME)分为四种类型：PD-L1−/TIL−(I型)、PD-L1 /TIL (II型)、PD-L1−/TIL (III型)和PD-L1 /TIL−(IV型)。
虽然在临床试验中已经研究了TIME亚型与生存结果之间的关系，但在临床试验之前仍有几个问题有待解决。
在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，TIME分类模型与免疫治疗效果的关系尚未被任何大规模随机对照临床试验所证实。
在TIME分类系统中，应该用什么标准来确定免疫渗透的状态仍存在疑问。如果没有化疗作为对照组，尚不清楚TIME分类模型是预测标志还是预后标志。
此外，以前对TIME亚型的研究广泛基于免疫组织化学方法，但很少对RNA测序数据进行检验。
这里，我们使用随机对照III期研究(Orient-11研究)的基线肿瘤样本的RNA测序和免疫组化数据，全面评估晚期NSCLC患者免疫治疗加化疗的TIME亚型和生存益处之间的关系。
研究方法：
研究设计和研究人群
ORIENT-11是一项在中国47个中心进行的随机、双盲、3期临床研究。未经治疗、局部进展期或转移性非鳞状非小细胞肺癌但未致敏化EGFR或间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因组异常的患者随机(2：1比例)接受信迪利单抗(抗PD-1抗体)或安慰剂加培美曲塞和铂，每3周1次，共4个周期，随后信迪利单抗或安慰剂加培美曲塞作为维持治疗。治疗一直持续到疾病进展、无法忍受的毒性、开始新的治疗或撤回同意为止。
主要终点是无进展生存率(PFS)。总生存率(OS)和客观反应率(ORR)是次要终点。
文库构建和RNA测序(RNA-seq)
在Orient-11试验中，所有肿瘤标本均通过活检获得。使用RNasy福尔马林固定、石蜡包埋试剂盒(QIGEN)从福尔马林固定、石蜡包埋的基线肿瘤标本中提取RNA，并使用NEBNext rRNA耗竭试剂盒(NEB)去除核糖体RNA。用于Illumina的NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒按照制造商的建议用于互补DNA文库的制备。
首先使用二价阳离子进行碎裂，然后构建链特异的RNA测序(RNA-seq)文库。RNA-SEQ在NovaSeq 6000系统(Illumina)上进行。使用FastQC进行读取质量控制，原始读取被Trimomatic过滤，并使用校准器定位到人类GRCh38参考基因组。仅具有至少30%的唯一读取映射率和读取重复率最高为90%的样本用于下游分析。HTSeq-count命令用于基因表达水平通过每百万转录量(TPM)进行量化，用于基于原始读数和转录本长度的标准化。
基于RNA测序的肿瘤免疫浸润性评价
使用R IOBR程序包从RNA-seq数据进行肿瘤微环境(TME)去卷积，该程序包集成了Estimate、QuanTIseq、Xcell等8种开源细胞类型量化方法。Estimate（使用表达数据估计恶性肿瘤中的间质和免疫细胞)是一种算法，它利用癌症样本转录图谱的独特性质来推断肿瘤细胞和浸润性间质和免疫细胞。
quanTIseq是一种从大量RNA测序数据中定量计算10种免疫细胞类型的方法。它可以使用去卷积方法量化免疫细胞的绝对比例，并已在血液和肿瘤样本中得到广泛验证，使用模拟、流式细胞仪和IHC数据。
xCell是一种基于基因签名的方法，可以根据RNA-seq数据推断64种免疫和基质细胞类型。Xcell的准确性已在模拟表达谱和细胞免疫图谱中得到验证。为了确定反映肿瘤免疫浸润的最好预测生物标志物，我们计算了CD8 T细胞、TIL和TIICs的得分，以进行进一步的比较分析。
应用免疫组织化学和RNA测序技术评价PD-L1的表达
PD-L1免疫组化法是在一个中心实验室(上海，中国)，使用22C3 PharmDx分析对基线肿瘤福尔马林固定的石蜡包埋组织进行的。
用肿瘤比例评分(TPS)检测肿瘤PD-L1蛋白的表达，定义为在任何强度下部分或完全显示膜染色的活肿瘤细胞的百分比。PD-L1mRNA的表达水平用每百万转录本进行标准化来定量。
TIME亚型的定义
如前所述，根据PD-L1表达和TIL的存在，TIME可以分为四种类型：PD-L1−/TIL−(类型I型)；PD-L1 /TIL (类型II)；PD-L1−/TIL (类型III)；以及PD-L1 /TIL−(类型IV)。
我们从RNA-seq数据中确定CD8 T细胞/TILs/TIICs的中位数作为联合组和化疗组TIL密度高低的分界点。同时，以PD-L1mRNA表达的中位数作为联合组和化疗组PD-L1高表达或低表达的分界点。
对于PD-L1的免疫组化分析，分别以1%、5%、10%和50%的TPS分界点来区分PD-L1的高表达和低表达。
MHC-II类抗原提呈途径分析
由于我们在之前的Orient-11试验研究中证实MHC-II类抗原提呈通路是一个预测生物标志物，我们进一步研究了抗原提呈与TIME亚型的关系。
对于抗原提呈途径的分析，我们采用了一个包含15个MHC II类基因的基因集。每个MHC II类基因集首先用z-Score衡量，然后在基因之间取平均值，以达到它们的表达水平。
生存和统计分析
为了量化每个生物标志物的预测价值，我们计算了免疫治疗加化疗与化疗在该变量的每个水平上的比率。变量的预测值被定义为该变量每一水平上的HR比率。
分类变量和连续变量的比较分别采用卡方检验和Wilcoxon秩和或Kruskal-Wallis检验。根据PD-L1表达和免疫浸润绘制Venn图，以可视化TIME分类模型。
用Spearman等级相关系数(Rs)估计PD-L1表达与肿瘤免疫浸润的相关性。
生存分析采用Kaplan-Meier方法对PFS和OS进行分析。采用分层对数秩检验评价两组治疗差异。用COX比例风险模型计算危险比(HR)和相关的95%可信区间(CI)。
研究结果：
患者基线信息
在Orient-11试验中的397名参与者(ITT，意向治疗)中，我们利用PD-L1 TPS和RNA-seq的现有数据分析了生物标记物可评估人群(BEP)，其中包括113名接受抗PD-1治疗加化疗的患者(联合组)和56名接受化疗的患者(化疗组)。
基线临床特征和PFS在BEP和ITT队列中很好地平衡。此外，联合组和化疗组的临床特征和PD-L1的表达是平衡的。
反映免疫渗透的生物标志物的预测价值
在反映肿瘤免疫渗透的所有变量中，最具预测性的生物标志物是通过估计方法计算的免疫评分，它代表TIICs的水平(图1A-B)。
在PFS分析中，联合治疗与化疗相比，高免疫评分亚组的HR为0.20(95%CI，0.11~0.36；P<.001)，低免疫评分亚组的HR为0.77(95%CI，0.46~1.29；P=.31)，预测值为2.85，有利于高免疫评分。
此外，Xcell或quanTIseq估计的TIL和CD8 T细胞的丰度对联合治疗的疗效的预测价值较小，但相当可观(图1A-B)。在OS分析中，免疫评分的预测价值最高。
反映PD-L1表达的生物标记物的预测价值
对于反映PD-L1表达的变量，mRNA的预测值似乎比TPS更好，高表达亚组的HR为0.21(95%CI，0.12-0.37；P<.001)，低表达亚组的HR为0.71(95%CI，0.42-1.20；P=0.20)，预测PFS的值为2.38(图1C-D)。OS分析的结果是相似的。我们还研究了哪个TPS分界点可能最具预测性。TPS切点为1%、5%、10%和50%时，PFS的预测值分别为0.63、0.70、1.03和0.96，OS的预测值分别为0.70、0.75、1.00和1.64(图1C-D)。
在所有临界点中，使用50%的阈值最能预测联合治疗的疗效，高表达亚组的HR为0.36(95%CI，0.20-0.63；P<.001)，低表达亚组HR为0.95(95%CI，0.55~1.64；P=0.86)，对OS的预测值为1.64。
最重要的是，PD-L1mRNA表达和通过估计计算的免疫评分对免疫治疗加化疗的疗效具有最高的预测价值。因此，选择它们来建立TIME分类模型。
PD-L1表达与免疫浸润的关系
根据PD-L1mRNA表达中位数和免疫评分中位数，将联合组和化疗组患者分为四组：PD-L1−/TIL−(I型)、PD-L1 /TIL (II型)、PD-L1−/TIL (III型)和PD-L1 /TIL−(IV型)。TIME亚型分别为61例(36.1%)、62例(36.7%)、23例(13.6%)、23例(13.6%)。
在85例PD-L1高表达患者中，62例(72.9%)同时存在高肿瘤免疫浸润(图2A)。此外，我们发现PD-L1mRNA的表达与免疫评分显示出显著的相关性(Rs，0.53；P<.001)(图2B)。卡方检验也证实了晚期NSCLC患者PD-L1表达与肿瘤免疫浸润的相关性(P<0.001)。
基于TIME分类模型的生存分析
在综合治疗和化疗之间的比较中，只有II型亚型与PFS的改善(HR，0.12；95%CI，0.06-0.25；P<.001)和19个OS(HR，0.27；95%CI，0.13-0.55；P<.001)有统计学意义的相关性，后者具有高免疫评分和高PD-L1mRNA表达(图3)。
在联合组中，II型亚群的生存TIME要长得多，甚至没有达到PFS或OS的中位数(图4A-B)。其他三个亚型(亚型I：7.1个月；亚型III：7.1个月；亚型IV：7.1个月)的PFS似乎相同，而亚型III和IV的OS相对较长(亚型I：14.6个月；亚型III：24.5个月；亚型IV：18.4个月)。
此外，亚型II的ORR最高(亚型I：56.1%；亚型II：85.7%；亚型III：53.3%；亚型IV：60.0%)。化疗组TIME亚型在PFS和OS上无明显差异(图4C-D)。不同亚型的ORR不同(亚型I：30.0%；亚型II：50.0%；亚型III：37.5%；亚型IV：50.0%)。
图3.基于TIME分类模型的联合组和化疗组的比较生存分析。
基于TIME分类模型的生存分析
在联合组中，II型亚群的生存TIME要长得多，甚至没有达到PFS或OS的中位数(图A-B)。
其他三个亚型(亚型I：7.1个月；亚型III：7.1个月；亚型IV：7.1个月)的PFS似乎相同，而亚型III和IV的OS相对较长(亚型I：14.6个月；亚型III：24.5个月；亚型IV：18.4个月)。
图4.按TIME分类模型分层的联合组和化疗组的生存结果。
基于TIME分类模型的多元回归分析
在联合组中，II型与改善的PFS(HR=0.22; 95%CI, 0.11-0.44; P<0.001)和OS(HR=0.30; 95%CI, 0.16-0.55; P<.001)以及更高的ORR(优势比，4.91；95%CI，1.72-15.77；P=0.004)显著相关。在其他三个亚型中没有观察到显著的差异。
在化疗组中，生存结果与TIME亚型之间没有显著关联(图5C-D)。在PD-L1、TPS和CD8 T细胞定义的其他TIME分类模型中也观察到了一致的结果。只有CD8 T细胞和PD-L1mRNA高表达的患者PFS改善(HR，0.10；95%CI，0.04-0.23；P<0.001)和OS改善(HR，0.21；95%CI，0.10-0.44；P<0.001)。亚型II高PD-L1表达和高免疫浸润与联合治疗的最佳临床结果相关，而化疗组不同TIME亚型的生存结果无显著差异。
图5.生存结果的多变量Cox回归分析。
按活检部位分组的生存分析
为了探索活检部位对TIME分类模型的潜在影响，我们根据标本是来自原发部位还是转移部位进行了亚组生存分析。在原始样本中，TIME分类模型在预测免疫治疗效果方面仍然有效。
联合组中仅II型亚群有较长的PFS，而化疗组中TIME亚型无明显差异。然而，在转移性样本中，样本大小有限，TIME分类模型似乎不能很好地预测生存结果。
TIME分类模型与抗原提呈途径的相关性
在之前的Orient-11试验研究中，联合组MHC-II类抗原提呈通路的表达与PFS和OS益处都相关。
高PD-L1表达和高免疫浸润的亚型人群中MHC-II类抗原提呈途径的表达最高。
免疫浸润程度高而PD-L1表达水平低的患者MHC-II类抗原提呈途径也丰富。而免疫浸润程度低的I、IV亚型患者，其抗原提呈的表达水平明显降低。
总体而言，这些发现支持MHC II类抗原呈递与免疫浸润相关，而不是PD-L1表达。
研究局限性：
在我们的研究中应该考虑到局限性。首先，这是一项在接受免疫治疗联合化疗的晚期非小细胞肺癌患者中进行的回顾性研究。在其他癌症患者中还需要进一步的验证。
此外，与PD-L1的IHC分析不同，RNA-seq并不是治疗晚期人类癌症的常规测试。如何以更便宜、更方便的方法评价免疫渗透状态仍有待探索。
研究结论：
总而言之，PD-L1高表达和高免疫渗透的晚期NSCLC患者实际上可以在一线治疗的基础上接受抗PD-1治疗和化疗。对于缺乏PD-L1表达或免疫浸润的患者，化疗可能是更好的治疗选择。在其他癌症患者中验证TIME分类模型的预测能力是非常需要的，以指导临床实践中的精确医学。
翻译及审校：吴思凯
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