肿瘤相关成纤维细胞（CAF）在TME中的累积与结直肠的进展和复发密切相关，也与肿瘤免疫反应性密切相关。而趋化因子CXCL12（也被称作基质细胞衍生因子1，SDF1）多数由CAF分泌，与CXCR4或CXCR7结合后可以招募特定的免疫细胞亚群而导致TME的免疫抑制状态，进而促进肿瘤进展。但是调控TME中CXCL12水平的因素有待研究。
另一方面，生酮饮食（KD）在多项基础研究中被证实对肿瘤生长有抑制作用，并被观察到对结肠癌、黑色素瘤、肾癌、非小细胞肺癌等的免疫检查点封锁（ICB）治疗起到积极作用。但是生酮作用在免疫抑制微环境中的动态变化和具体机制仍然不清楚。
1.KD减少免疫抑制细胞的积累，增加TME中NK细胞、T细胞的数量
研究者通过对免疫功能完备的C57肠癌小鼠和免疫功能缺陷的肠癌裸鼠喂养KD,发现KD导致的肿瘤抑制作用可能与TME中免疫状态相关（图1AB，补图1C）。随后对C57小鼠肿瘤组织进行流式分析，也发现KD喂养的小鼠TME中T细胞（尤其是CD8 T细胞）浸润更多（图1C-E），而巨噬细胞，尤其是M2型巨噬细胞减少（图1F、G）。
图1
为了进一步确定KD诱导的肿瘤浸润免疫亚群的改变形式，研究者对肿瘤浸润CD45 白细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)并进行聚类分析，确定了11类细胞簇，并得到了与流式分析一样的结果，此外还观察到KD组的小鼠TME中NK细胞增多、CD4 Treg细胞减少（图1H-K）。
这些结果提示生酮作用抑制了TME免疫抑制状态的出现，增强了抗肿瘤免疫反应。
2.生酮作用的增加抑制了CAF中CXCL12的表达
之前有报道显示，CAF可能通过分泌CXCL12参与TME中免疫抑制状态的维持。为了探究生酮作用抑制免疫抑制状态是否与CAF有关，研究者们构建了过表达生酮酶HMGCS2的原代人CAF（hCAF-05和hCAF6231），并对其进行了RNA测序，发现过表达HMGCS2的CAF中CXCL12的mRNA表达减少；且在不影响CAF生物标志物ACTA2、S100A4和MMP4的情况下，酮体β-羟丁酸（βHB）产生增多（图2A）,对细胞裂解液、细胞上清液进行RT-PCR、ELISA发现CXCL12蛋白水平也出现下降（图2B、C）。而过表达HMGCS2-C166A(酶活突变)的CAF中CXCL12mRNA的表达、细胞裂解液中βHB表达并无影响（图2A）。另一方面，给予CAFβHB处理后，其CXCL12mRNA和蛋白表达明显受到抑制（图2D、E）。而在给予KD饮食的小鼠原代CAF中同样观察到CXC12mRNA水平的降低（图2F）。而βHB处理并不影响正常结肠成纤维细胞内CXCL12mRNA的水平。这提示了生酮作用对CAF内CXCL12表达的特异性抑制。
图2
3.KLF5介导CXCL12表达的调控
在对过表达HMGCS2的CAF进行RNA-seq的结果还提示了KLF5mRNA的降低，RT-PCR同样证实了这一点（图3A、B）。在对人的原代CAF和小鼠CAF进行βHB处理后，研究者们发现KLF5在蛋白水平也出现了下降（图3C）。因有报道提示，βHB可以作为I类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的内源性抑制剂，从组蛋白H3赖氨酸9（H3K9ac）乙酰化的增加中可以看出，βHB抑制了CAFs中HDAC的活性，而使用I型HDACs的外源性抑制剂丁酸钠（NaBT）或HDAC1的选择性抑制剂MS-275处理hCAF-05，或对hCAF-05进行HDAC1进行敲低处理后，细胞的KLF5(而非KLF4)表达受到抑制（图3C）。这些结果提示生酮作用的增加通过抑制CAF的HDAC1来抑制其KLF5表达。
接着，研究者们开始探究KLF5是否调控CXCL12表达。对hCAF-05进行过表达KLF5腺病毒（Adv-KLF5）感染后，细胞CXCL12的mRNA和蛋白表达水平明显增加（图3D、E），而对过表达KLF5的CAF进行βHB处理，CXCL12的mRNA表达并未降低（图3D）。另一方面，对CAF的KLF5进行敲降或外源性抑制后发现其CXCL12mRNA、蛋白表达降低（图3F-H）。这些结果提示生酮作用通过抑制KLF5表达来抑制CXCL12表达。
KLF5可以通过与启动子原件结合而促进靶基因的转录，其重要的结合序列为5’-GGGGTGGG-3’。结合以往研究，研究者们预测了KLF5与CXCL12启动子结合的两个基序，并通过CAF进行了染色质免疫共沉淀（ChIp）对预测位点进行了确认，且发现KLF5基序1主要与CXCL12启动子区域进行结合，而HMGCS2过表达能使两者的结合减弱（图3I、J）。对CXCL12启动子区域进行克隆后，将其与KLF5过表达质粒进行共孵，发现CXCL12启动子活性明显增加，而如果KLF5结合基序1被删除，其诱导的CXCL12启动子活性增加的效果也随之消失（图3K、L）。这些结果提示KLF5通过结合CXCL12启动子诱导其转录。
图3
4．增加生酮抑制CAF生长
将不同的CAF用βHB处理6天，发现CAF的增殖受到抑制,而过表达HMGCS2也能抑制CAF的增殖（图4A-D）,具体表现为G0/G1期阻滞，以及p53、p21Waf1表达的增加（图4E、F）。在体内研究中，用WB检测CAFmarker α-SMA,发现KD喂养后荷瘤小鼠TME内CAF减少（图4G、H）。
而前述结果提示了生酮作用与KLF5调控CAF中CXCL12表达的内在关联，因此接着研究者们通过对CAF进行过表达KLF5和βHB处理，发现酮体导致的CAF生长抑制被KLF5过表达逆转，而KLF5敲低导致了CAF的增殖减少（图4I、J）。
以上两个结果证实，CAF的增殖受到HMGCS2/βHB/KLF5信号的调控。
图4
5.结直肠癌患者的生酮处于下调状态
以上结果提示KLF5依赖的CXCL12表达对TME的免疫抑制状态起到重要作用，而生酮可以抑制这种状态的产生。接着研究者们将眼光转到临床，发现βHB、HMGCS2在大部分结直肠癌患者组织内下调，而CXCL12高表达（图5A-C）。对肠癌肝转移灶组织进行免疫组化分析，发现HMGCS2下调和KLF5、CXCL12上调存在相关性（图5D）。
图5
6.KD抑制肿瘤内CXCL12表达，增强PD-1阻断治疗的疗效，抑制了肿瘤的生长和转移
基于以上结果，研究者们采用KD喂养结肠癌荷瘤小鼠，发现KD小鼠βHB表达在血浆和肿瘤内都明显上升，CXCL12表达明显减少（图6A-E）。因为有研究提示CXCL12与结肠癌ICB耐药相关，因此研究者们探究KD与ICB疗效之间的关系，发现KD喂养小鼠在PD-1阻断治疗中获得了更好的肿瘤抑制疗效（图6F-J）。
图6
由于CXCL12CXCR4/CXCR7还被报道与肿瘤的转移相关，研究者进一步研究了KD饮食与结肠癌转移间的关系。体外实验发现过表达HMGCS2的CAF细胞的培养上清液可以抑制结肠癌细胞的迁移（图7A-C）；小鼠实验发现KD饮食减少了小鼠结肠癌的肝、肺转移，且在KD喂养的荷瘤小鼠转移灶中βHB表达升高，CXCL12表达下降（图7D-G）。
图7
以上结果提示KD抑制肿瘤内CXCL12表达，增强PD-1阻断治疗的疗效，抑制了肿瘤的生长和转移。
酮生成减少是结直肠癌的标志之一，而酮生成增加可以抑制CAF中KLF5依赖的CXCL12表达，从而抑制TME中的免疫抑制状态，增强了PD-1阻断的治疗作用，抑制了结直肠癌的肝肺转移。提示了使用KD对抗CRC免疫抵抗和转移的潜在益处。
1.本研究将肿瘤研究领域的热点——CAF、肿瘤代谢、免疫治疗结合起来，系统地阐述了三者的关系，相关实验思路和实验方法值得借鉴学习；
2.提示CXCL12信号可能是结直肠癌免疫治疗的疗效预测因子，具有临床转化价值；
3.提示饮食结构或对肿瘤免疫治疗起到一定作用，对临床实践有一定的指导意义。
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