发表杂志：Cancer Immunol Res
影响因子：8.728
发表时间：2022 Jul 01
使用组学技术：TMT蛋白质组学、外显子组测序(WES)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)
肝内胆管癌(ICC)是继肝细胞癌之后的一种相对罕见但具有高度侵袭性的原发性肝脏肿瘤，占所有原发性肝脏恶性肿瘤的5%至10%。ICC是一种异质性的恶性肿瘤，可在肝内胆道树的任何位置发现，具有独特的遗传和基因组特征，因此导致生存结果的差异。手术切除是治疗ICC的有效方法。然而，ICC患者往往在晚期才被诊断出来，此时切除是不可能的，只能使用姑息性化疗。
肝内胆管癌(ICC)是一种相对罕见但高度侵袭性的肿瘤类型，对化疗和免疫治疗反应较差。对ICC进行全面的分子表征对于开发新的治疗方法至关重要。在这里，作者从两个诊断中心建立了两个独立的队列。通过蛋白质组学、外显子组测序(WES)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)对ICC进行了全面的多组学分析。在训练队列(n=110)中，利用蛋白质组学特征及其相关的激活途径衍生出新的ICC肿瘤亚型，并在验证队列(n=41)中进一步验证。三种分子亚型，染色质重塑、代谢和慢性炎症，在ICC中具有不同的预后。慢性炎症亚型与预后不良相关。随机森林算法显示，赖氨酸甲基转移酶2D (KMT2D)突变经常发生在代谢亚型中，并与较低的炎症活性相关。scRNA-seq进一步鉴定出APOE C1QB 巨噬细胞亚型，该亚型显示出重塑慢性炎症亚型的能力，并导致ICC患者预后不良。总之，通过单细胞转录辅助多组学分析，作者确定了ICC的新分子亚型，并验证了APOE C1QB 肿瘤相关巨噬细胞是针对ICC的潜在免疫治疗靶点。
本研究的样本采集(原发肿瘤组织和血液样本)于2014年至2021年。肿瘤组织用福尔马林固定石蜡包埋，血样液氮保存。在该ICC队列中，共有84.5%的患者是HBV感染，这与之前的研究不同。所有样本均通过病理检查评估癌细胞的比例和纤维化/坏死的程度。确定每张载玻片是否存在组织学坏死，并记录为阴性(坏死面积≤5%)或阳性(坏死面积>5%)。如果经过彻底的病理检查，估计肿瘤组织在载玻片上的比例大于90%，则将样品用于蛋白质组学分析。研究中没有肝门周围癌、远端癌和肝胆管合并癌。
为了全面表征ICC肿瘤的分子特征，作者对110例患者的ICC组织进行蛋白质组学分析。共鉴定和定量了10888个蛋白质，经过过滤保留6311个蛋白质的矩阵数据进入下游分析。该项目基于蛋白质组数据使用Bioinformatics上发表的无监督机器学习的方法，使用ConsensusClusterPlus函数满足对癌症肿瘤样本进行分类，实现分子分型。
ICC队列被分为三个不同的簇(C1, C2和C3)，最优共识k值为3。这些聚类在患者的PCA图中都是可区分的。对每对分子亚型进行差异表达蛋白（Differentially expressed protein，DEP）分析。在三种分子亚型之间的所有比较中，共有85种蛋白质被鉴定为差异表达，其中32个蛋白在亚型1中上调，24个蛋白在亚型2中上调，29个蛋白在亚型3中上调。作者根据这三组蛋白GO分析结果，将这三种分子亚型标注为“慢性炎症”(亚型1)、“代谢”(亚型2)和“染色质重塑”(亚型3;图1B和C)。使用相关基因集对蛋白质组学数据进行基因集变异分析(GSVA)，结果显示慢性炎症亚型的炎症反应评分高于其他两种亚型(图1D)。同样，代谢亚型中代谢评分最高，染色质重塑亚型中染色质重塑评分最高(图1E和F)。
图1 具有不同预后的ICC分子亚型
为了进一步探索这三种分子亚型的基因组特征，在训练队列中使用人类ICC肿瘤进行WES测序，并描绘了78个样本的基因组全景(图2A)。ARID1A、KRAS、PBRM1、BRCA2、CREBBP、TP53、KMT2D、ATM和ATRX是ICC肿瘤组织中最常见的突变基因(图2B)。在慢性炎症和代谢亚型中均发现KMT2Dmut。在所有确定的突变中，只有KMT2Dmut与ICC患者更好的预后显著相关(图2F)。代谢亚型中KMT2Dmut的比例也非常高。与KMT2Dwt组织相比，KMT2Dmut组织具有更高的代谢评分和更低的炎症评分(图2H和图2I)。总的来说，作者确定KMT2Dmut与ICC亚型的慢性炎症和代谢有关。
图2机器学习方法识别KMT2Dmut与ICC炎症反应的关联
作者剖析了不同亚型ICC的免疫全景。使用ssGSEA方法评估3种分子分型每种细胞类型的基因标记来估计21个免疫细胞群的丰度(图3A)。慢性炎症亚型中巨噬细胞的丰度明显更高(图3B)。进行免疫组化染色以验证蛋白质组学分析的结果，正如预期的那样，在慢性炎症亚型样本中发现的巨噬细胞多于其他两种亚型(图3C和D)。作者还观察到，KMT2Dwt组患者中发现的巨噬细胞多于KMT2Dmut组(图3E)，免疫组化染色证实了KMT2Dwt中巨噬细胞数量多于KMT2Dmut组织(图3F和G)。
图3 三种分子亚型的免疫全景
为了进一步表征慢性炎症亚型的免疫特征，作者对慢性炎症亚型的肿瘤组织进行了scRNA-seq。ICC肿瘤微环境(TME)共鉴定出10种细胞类型，包括恶性细胞、成纤维细胞、内皮细胞和各种免疫细胞；图4)。然后确定每种细胞类型中的特征基因，如SPP1、S100A6、FGG、GDF15、FGB在恶性细胞中高表达。作者接下来关注慢性炎症TME中的肿瘤相关巨噬细胞（Tumorassociated macrophage，TAM），因为发现TAM是三种亚型之间的主要差异。巨噬细胞进一步分为两类：1型和2型(图4B)。几种M2巨噬细胞标记物（IL10、IL1B、HLADRA和CD163）在1型和2型集群中均有表达。作者分几个步骤对两种类型的巨噬细胞进行了表征。采用GSVA法计算两种亚型TAM的炎症反应评分。2型TAM表现出明显高于1型TAM的炎症反应评分(图4C和D)。然后在两个TAM亚组之间进行差异表达基因(DEG)分析。APOE、LIPA、CTSD、C1QB和其他几个基因在2型TAM中显著上调(图4E)。作者利用2型TAMs中上调的基因进行GO分析，发现富集对炎症反应有正向调节，对免疫系统有负向调节，提示2型巨噬细胞可能参与了ICC中炎症反应的调节(图4F)。通过检测APOE/CD68和C1QB/CD68，验证了APOE和C1QB在2型TAM中的共表达(图4G-I)。在慢性炎症亚型中，APOE TAMs的数量高于其他两个亚型(图4J-K)。KMT2D野生型组织中APOE TAMs的数量高于KMT2Dmut组织(图4L和M)。慢性炎症亚型APOE C1QB TAM得分最高(图4N)，表明2型APOE C1QB TAM是慢性炎症亚型ICC的主要决定因素。KMT2Dwt患者的2型APOE C1QB TAM评分高于KMT2Dmut患者(图4O)，且2型APOE C1QB TAM评分高的患者的OS明显差于2型APOE C1QB TAM评分低的患者。
图4 scRNA-seq鉴定APOE C1QB TAMs
KMT2Dmut如何重塑ICC 免疫微环境？首先，作者筛选了一系列人ICC细胞系，发现KMT2D在CCLP1细胞中高表达，而在HCCC9810细胞中低表达(图5A)。因此，作者选择了这两种细胞系，并将它们与PMA诱导的THP1来源的M0巨噬细胞共培养。通过IF染色和qRT-PCR检测APOE和C1QB的表达(图5B)。IF显示与CCLP1细胞共培养的M0巨噬细胞的APOE和C1QB表达明显高于与HCCC9810细胞共培养的M0巨噬细胞(图5C和D)。通过FACS对巨噬细胞进行分类，然后进行qRT-PCR。M0巨噬细胞与ICC细胞(HCCC9810或CCLP1)共培养的M0细胞中APOE和C1QB的表达高于单独培养的M0细胞，证实了ICC恶性细胞诱导APOE C1QB (图5E)， M0巨噬细胞与CCLP1细胞共培养的APOE和C1QB的表达明显高于M0巨噬细胞与HCCC9810细胞共培养的APOE和C1QB(图5D和E)。作者研究了APOE C1QB TAMs如何促进ICC TME的炎症。根据APOE C1QB TAM和CD4 T细胞ssGSEA评分，作者发现APOE C1QB TAM丰度高的患者CD4 T细胞浸润更高(图5F)。在APOE C1QB TAMs中，根据IL6、CD40、CXCL16等基因调节T细胞靶基因的活性，它们被列为最具潜力的配体(图5J)。T细胞下游基因包括AHR、CCL20、CCL5、CSF1、IL7R、IRF1、TNF、TNFRSF1B等参与T细胞炎症反应调控的关键重要基因。由于TNF是APOE C1QB TAM中大多数配体的靶标，因此作者在共培养实验中重点研究了APOE C1QB TAM对T细胞的影响。KMT2Dhigh CCLP1细胞和KMT2Dlow HCCC9810细胞与M0巨噬细胞和T细胞共培养(图5K)。通过流式细胞术(FACS)来阐明APOE C1QB 巨噬细胞对T细胞的影响(图5L)。作者的研究结果表明，当细胞共培养时，CD4 T细胞中的TNFa上调APOE C1QB 巨噬细胞(图5M)。KMT2DhighCCLP1细胞、M0巨噬细胞和CD4 T细胞共培养导致CD4 T细胞中TNFa表达最高(图5N)。
图5 APOE C1QB TAM影响CD4 T细胞的炎症活性
由于APOE C1QB TAM是驱动ICC慢性炎症亚型的最重要因素，预后最差，因此作者试图在小鼠ICC肿瘤模型中使用阻断性CSF1R抗体靶向APOE C1QB TAM来消耗TAMs(图6A)。我们发现CSF1R抗体处理组的肿瘤组织负荷明显降低(图6B和C)。H&E染色用于评估ICC肿瘤模型的性质(图6D)。Ki67染色显示，CSF1R抗体处理组的增殖低于对照组(图6E)。IF染色显示，与对照组相比，CSF1R抗体处理组APOE C1QB 的数量更少(图6F-G)。在CSF1R抗体处理组中，APOE C1QB TAM的比例低于对照组(图6H)。在CSF1R抗体治疗后，APOE C1QB TAM被耗尽，并且通过FACS分析TNF信号量化观察到较少的T细胞炎症(图6I-J)。这些结果表明APOE C1QB TAM可能是针对ICC的免疫治疗的潜在靶点。
图6 体内实验显示APOE C1QB TAMs在调节炎症中的作用
ICC是一种相对罕见但高度侵袭性的癌症类型，其5年生存率较低。ICC的临床特征和生存结果在不同的队列中存在差异，因此需要一种新的基于分子分类的预后模型。然而，相对罕见的ICC病例阻碍了分子模型的构建和验证。因此，在本研究中，作者收集了相对较多的ICC组织，并通过系统级多组学分析提供了ICC的全面分子表征。发现了三种新的分子亚型，并探讨了不良预后的潜在分子机制。与之前的研究一致，作者发现炎症是ICC的关键调节因子。在训练和验证队列中，与其他两种亚型的患者相比，慢性炎症亚型的患者表现出最差的生存结果。通过ssGSEA的蛋白质组学数据，发现巨噬细胞主要与ICC的慢性炎症亚型相关。因此，作者将重点放在单细胞转录组水平的巨噬细胞群体上。对慢性炎症亚型的肿瘤组织进行scRNA-seq分析，并进一步确定巨噬细胞群体。M1和M2巨噬细胞存在于各种不同性质的肿瘤中。M1巨噬细胞在炎症反应中高度活跃，通常被认为是抗肿瘤巨噬细胞，而M2巨噬细胞可以通过失调肿瘤细胞的几个关键通路来促进肿瘤细胞的生长和逃避。与传统的M1和M2分类不同，在此项研究中，ICC TAM被分为两个具有不同分子特征的亚型。2型TAM的M1和M2评分均高于1型TAM，提示ICC巨噬细胞应采用新的分类方法。2型TAM的特点是APOE和C1QB的高表达，以及高炎症反应评分，这意味着2型APOE C1QB TAM在重塑TME炎症反应中的重要性。在慢性炎症亚型中也发现了高丰度的APOE C1QB TAM，这暗示了APOE C1QB TAM在ICC炎症反应中的重要性。总之，本研究为scrna -seq辅助的ICC分子分型过程引入了一种新的工作流程。确定了三种分子亚型，用于对不同预后的ICC患者进行分层。特别是慢性炎症亚型与最差的预后相关。KMT2D突变被发现显著参与ICC的炎症反应和代谢活性，APOE C1QB TAM亚型显示出影响T细胞的能力，因此重塑了ICC慢性炎症亚型中TME的炎症景观。
像ICC这样罕见但侵袭性和几乎普遍致命发病率正在增加的恶性肿瘤，目前主要通过手术切除早期疾病和局部晚期或转移性疾病患者的细胞毒性治疗来治疗，但最近多模式治疗的方案对提高生存率做出了很大的贡献。多组学的技术手段联用，可以提供多方位的思考，类似本文分子分型的方式就为后期有效提升治愈率打下理论基础，后期可以推广至更多的疾病类型中应用。
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