lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而大量研究表明，lncRNA在细胞核内、核外，通过染色质修饰，转录调控，转录后调控等多种方式调节基因表达，在肿瘤发生发展中具有重要作用。
lncRNA功能研究的基本思路
一般来说，lncRNA功能研究的主线包含3个主要步骤：
（1）高通量筛选。全转录组测序和lncRNA芯片是目前最常用的技术手段，通过这种高通量的筛选方法，可以快速获得不同实验组间差异表达的lncRNA和mRNA。
（2）候选lncRNA的确定。通过生物信息学分析，从大量lncRNA 中筛选有潜在功能意义的lncRNA。
（3）目标lncRNA的功能分析与验证。根据上述生物信息分析推断出lncRNA可能的生物学功能，并设计相应的实验来验证假设是否成立。
lncRNA研究的基本流程
LncRNA的一般研究策略
1. lncRNA筛选
通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，预测lncRNA的靶基因，构建共表达网络；通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
lncRNA筛选建议
根据统计学筛选，比如fold-change和p-value，同时表达量高的
根据lncRNA在基因组上的位置进行筛选
根据lncRNA的靶基因进行筛选，筛选和表型相关的lncRNA
根据lncRNA与mRNA在表达上的协同关系进行推断，筛选具有hub地位的lncRNA
根据lncRNA与protein的关系进行筛选
根据lncRNA与miRNA的靶向关系筛选
2. lncRNA全长克隆
可以通过5'RACE获取lncRNA 5'全长，3'RACE获取lncRNA 3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。
3. lncRNA在细胞内的定位
通过FISH原位杂交技术定位，或者通过细胞核质分离试剂盒得到RNA，qRT-PCR检测其分布。如果是核内，那么，接下来考虑的作用方式可以就是染色质调控，转录调控（结合到启动子区，和某些转录因子互作，Pol II的抑制子……）；如果是核外，那么，考虑的作用方式可能是转录后调控（影响mRNA的稳定性，影响mRNA翻译，作为miRNA的”sponge”……）。此外，一些数据库比如RNALocate也可以帮助我们了解lncRNA的定位信息。
4. lncRNA的功能研究
lncRNA较长，承载的信息量多，更容易形成高级结构，其功能具有多样化和特异性强的特点。类似于miRNA，探讨lncRNA功能可用gain/loss of function 策略，过表达或沉默lncRNA后观察表型。即研究lncRNA功能获得后或者功能缺失后对细胞增殖、凋亡、侵袭、转移与克隆形成，以及病毒的转录复制等的影响。
（1）功能获得性研究
构建lncRNA过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。在构建 lncRNA表达质粒时，需关注lncRNA是否在蛋白编码基因的启动子区域或3′-UTR区域，勿遗漏重要区段。
（2）功能缺失性研究
可用siRNA、shRNA、反义核酸、CRISPR/Cas9等方法沉默lncRNA，经qRT-PCR或 FISH等验证后观察其对疾病相关基因表达和对细胞表型等的影响。
5.机制研究
lncRNA可与蛋白质、DNA 和 RNA 相互作用，但是目前最常用的还是利用体外转录、RNA pull down、RNA-RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）、CHIRP-seq（Chromatin isolation by RNA Purification）、MS 等技术手段。
6.表达调控
将lncRNA表达与其他领域相结合，解释其调控机理。
DNA甲基化和乙酰化：可通过检测相应基因甲基化、乙酰化差异与lncRNA结合分析。
转录因子：研究lncRNA与转录因子的调控机制。
7.体内验证
有条件的实验室，可以继续在体内或者临床样本水平进行验证。
lncRNA的作用机制不清楚，lncRNA的功能非常难研究。当前很多通过研究miRNA 与lncRNA的调控关系来揭示非编码RNA的功能，最热门的要数ceRNA调控网络。相关的可利用资源包括：
starBase平台构建了最全面的CLIP-Seq实验支持的miRNA和lncRNA的调控关系网络，包括构建了ceRNA调控网络 。
DIANA-LncBase数据库只是构建了基于单个CLIP-Seq数据的miRNA和lncRNA 调控关系。
LncRNA的一般研究实验手段
1.与蛋白质的相互作用
识别lncRNA的蛋白质伙伴，可以为它们的功能的机制和路径提高线索。RIP技术，如chemical-cross-linked RIP、native RIP (nRIP)、UV-crosslinked immunoprecipitation (CLIP)使用抗体来pulldown核蛋白复合物，然后从中分离相关RNA用于分析。每个变体都有它各自的优势和缺陷。nRIP提供交联产物，而CLIP在避免交联产物的重新组合的同时用于识别RNA与蛋白质相互作用位点。这些技术可以结合高通量测序，如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq，来识别lncRNA相互作用的全部宿主蛋白质因子，尽管还需要技术手段的确认。
2.与DNA的相互作用
有几个实验技术被用于识别lncRNA的基因组靶位点。以染色体免疫共沉淀（ChIP）和RIP技术的原理为基础，使用染色体RNA免疫共沉淀（ChRIP）来识别与特殊染色体标签相互作用的RNA。另一方面，chromatin oligo-affinity precipitation (ChOP)、chromatin isolation by RNA purification (ChIRP)、capture hybridization of RNA targets (CHART)使用标记的互补寡核苷酸来识别与目的RNA相互作用的DNA位点。
3.结构特征
lncRNA可以形成特殊的二级和三级结构来执行它们的功能。通过selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE)和in-line probing来获得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq，连接其它依赖于RNA酶消化的技术，如fragmentation sequencing (FragSeq)和parallel analysis of RNA structure (PARS)。
联系客服
