摘要
尽管生物等效性豁免的政策已成为各监管机构法律体制的一部分，但既没有就非高溶高渗型药物BE豁免的尺度达成共识，也没有就BDDCS达成一致性的官方文件（Biopharmaceuticsdrugdispositionclassificationsystem）。为了更好地理解BE豁免的适用性，我们开展一项现况调查，我们从巴西卫生监督机构的数据库中随机抽取500个药物的BE研究数据。旨在于评论在BCS分类或BDDCS分类下，如何表征药物本身和药物剂型对生物等效性的影响。样本数据中，试验药物按照BCS和BDDCS类别分类，以评价药物特性和剂型是如何影响BE试验的结果。结果显示：BCS或BDDCSⅡ类药的BE不等效风险是Ⅰ类或Ⅲ类药的4倍。因此，溶解度可能对BE试验的结果起到至关重要的作用，而肠道渗透性或代谢程度对其影响不大。
关键词：生物等效性豁免；BCS；BDDCS；生物等效性；溶出度；渗透性；溶解度
简介
1995年,Amidon等提出了生物药剂分类系统（BCS）的概念。根据药物吸收模型研究的结果表明，口服药物吸收主要受控于药物的两个特征，即生理条件下的溶解度和肠道渗透性，以及药物剂型的溶出速率。基于BCS系统，可按溶解性和肠道渗透性将药物分为4个类别，以此预测药物吸收的限速步骤：胃排空时间或肠道渗透性（高溶解药物属于BCSⅠ类或Ⅲ类）、体内溶出和/或溶解性（BCSⅡ类），或所有变量混合（BCSⅣ类）。同年，美国FDA开始采用BCS分类指导放大生产和批准上市后变更，并规不同级别的变更所需开展的试验。2000年，FDA首次将BCS分类理论用于新仿制药申报时的体内生物等效性豁免。通常，FDA规定生物等效性（BioequavalenceBE）豁免仅适用于高溶解、高渗透的口服固体速释制剂。该政策被一些专家认为过于保守，建议将BE豁免范围放宽其他BCS类型药物。目前，不同审评机构尚未达成一致性的观点，因为一些审批官认为BE豁免不仅仅适用于一个BCS类别，还应适用于按溶解性或渗透性界定的其它类别。而Potthast和Zheng已对这些共识和分歧做了总结和讨论。
欧洲药品管理局（EMA）将BCS分类药物的BE豁免尺度延伸至高溶解、低渗透的药物（如BCSⅢ类），但前提是该药物为速释剂型，其处方组成与参比制剂相同，用量与参比制剂相似。设定该前提条件是为了避免的膜转运蛋白作用带来的不可预料的影响。该指南与其他将BE豁免尺度放宽到BCSⅢ类的报告观点一致。然而，这种需要更严格的体外溶出标准以保证口服药物吸收仅受限于肠道渗透性的观点仍缺乏共识。
相反，WHO提出一个更灵活的方法，因为这不仅涵盖FDA和EMA推荐的基于BCS分类的生物等效性豁免范围，还延伸到BCSⅡ类的部分药物。WHO认为，在PH6.8的条件下，具有高溶解、高渗透的弱酸性药物也可申请生物等效性豁免。这是因为小肠是该类药物的主要吸收部位，与BCSⅠ类相似。但是，这种豁免模式在业界并未得到认同，尽管一些专家表示支持，仍受到很多质疑。
2005年，Wu和Benet修订了BCS的概念，试图解决渗透性定义上的歧义。他们提出高渗透药物通常主要通过代谢来消除，并以药物的溶解性和代谢程度为基础，提出了BDDCS分类系统。关于渗透性定义的歧义在其他报告中也有进一步阐述，但仍未解释清楚。尽管如此，BCS和BDDCS的支持者认为，药物的代谢程度将增加BCS应用的价值，因为它能更好地反映药物吸收情况。药物的代谢程度，可以用氧化或共轭酶形成的代谢物的量来表示。EMA指南第一个指出将代谢程度作为药物吸收的指标。值得注意的是，根据BDDCS分类，一些专家指出由于不同群体的基因分布多样性,药物代谢相关的基因多态性会导致不同分类。
鉴于采用BCS/BDDCS分类在BE豁免过程中的应用仍缺乏统一性，本文开展了现况调查，以评估BCS和BDDCS每个等级药物的BE不等效和BIE（bioinequivalent）风险。该项调查同时评估体外溶出用于预测两个分类系统的BE结果的情况。目的是采用回顾性数据来确定生物豁免扩展到Ⅱ和Ⅳ类药物可行性。
试验
该调查从巴西卫生监督局（ANVISA）内部的BE研究数据库中随机取样，该系统电子记录了从2008年起巴西开展的所有生物等效性研究，包括BE等效、BE不等效和BIE（bioinequivalent）结果（BIE指statisticpower（统计功效）＞80%的试验中，点估计值超过0.8-1.25的情况）。考虑到BCS每个类型的BE不等效结果已有报道，样本大小按OpenEpi2.3.1版统计，必须达到验前statisticpower的80%，显著水平达0.05%。由于BCSⅠ类和Ⅲ类药物的BE不等效结果存在较小差异，样本大小要求绝对拒绝无效的原假设（H0:relativerisk=1；总样本为13300个BE试验）远远高于生物等效性和药学等效性系统的总数。所以，样本大小仅考虑BCSⅠ、Ⅲ、和Ⅳ类与Ⅱ类对比。该算法表明BCS每个类型至少需要进行96项BE试验。考虑到注册仿制药中的BCS不同类别分布情况，我们随机从生物等效性和药学等效性系统中抽取500个样本药物的BE试验数据，足以统计评估药物特性（溶解性、肠道通透性和药物代谢程度）和剂型（体外溶出度）是如何影响BE试验的结果。所有的试验取样均由伦理委员会批准，由通过GLP和GCP认证的医药研发外包公司（CRO）执行，并遵照Helsinki宣言和巴西法律。并收集了经药典或验证试验后得出的有参考意义的体外溶出度数据。
药物分类
药物按照BDDCS进行分类，详见前面列表。该列表展示了在PH1.0-7.5范围内药物溶解度以及计算油水平衡系数clogP值，并采用clogP值对样本药物进行BCS分类。本文选择美托洛尔作为肠道渗透性的标准药物，是因为它的绝对生物利用度约为90%。在此基础上，clogP值高于或等于美托洛尔的药物均被认为是高渗透的药物。
数据分析
采用卡方检验（如适用，或费舍尔精确检验）测算生物不等效结果在BCS或BDDCS所有类型的占比。采用多个2*2列联表进行比较BCS或BDDCS每个类型的所有组合，并计算生物不等效或BIE的相关风险，以及它们的95%置信区间。数据分析采用SPSS17版软件进行统计分析，P<>
通过灵敏度（sensitivity）、特异性（specificity）、阳性似然比（LR+：likelihoodratiopositive）、阴性似然比（LR-：likelihoodrationegative）和验后概率（posttestprobability）等参数对体外溶出度试验与生物等效性结果间的可预测性进行评估。灵敏度是指假定一个仿制药是生物等效的，检测体外溶出曲线相似的条件概率。相反，特异性指假定一个仿制药是生物不等效的，检测体外溶出曲线不相似的条件概率。灵敏度和特异性的互补概率分别是假阴性和假阳性概率。LR+指灵敏度和假阳性概率的比值。换而言之，溶出试验的LR+是指生物等效药物可能出现相似的体外溶出情况比生物非等效药物多的倍数。相反，LR-是特异性和假阴性概率的比值，表示生物等效药物可能出现不相似的体外溶出曲线比生物非等效药物少的倍数。LR+大于1表明相似的体外溶出曲线与生物等效结果相关，而LR-小于1表明体内不相似的体外溶出曲线与生物非等效结果相关。因此，当LR的置信区间为95%和100%时是没有诊断价值（diagnosisvalue）的。尽管这四个指标概述了诊断准确性，但它们仅仅强调BE等效（或BE不等效）结果预测体外溶出结果的准确性，因为它们表明条件概率，即验前条件是体内试验的结果（如：给出BE结果，找到相似的体外溶出概率是多大）。然而，在监管领域内，人们对体外试验如何更好地预测BE结果更感兴趣。这是可以通过验后概率来评估的，而验后概率可以通过BE等效和BE不等效结果的验前概率和相似然函数（LR+、LR-）的组合计算出来。根据贝叶斯定理，这种组合概述了相似或不相似的体外溶出曲线是如何改变获得BE等效或BE不等效结果概率的验前知识。为了应用验后概率，需要用额外的计算方法（详见后面的参考）将可能性转换为概率。用代数的方法，这些诊断参数（diagnosisparameters）的定义参见下方（Table1）：
灵敏度=a/(a+c)[Sensitivity=a/(a+c)]
特异性=d/(b+d)[Specificity=d/(b+d)]
LR+=灵敏度/(1-特异性)[LR+=sensitivity/(1?specificity)]
LR-=（1-灵敏度）/特异性[LR?=(1?sensitivity)/specificity]
验后概率BE=验后比BE/（1+验后比BE）[PosttestprobabilityBE=posttestoddsBE/(1+posttestoddsBE)]
验后比BE=验前比BE*LR+[PosttestoddsBE=pretestoddsBE×LR+]
验前比BE=发生率BE/（1-发生率BE）[PretestoddsBE=prevalenceBE/(1?prevalenceBE)]
发生率BE=验前概率BE=（a+c）/(a+b+c+d)[PrevalenceBE=pretestprobabilityBE=(a+c)/(a+b+c+d)]
验后比BE不等效=验前比BE不等效*（1/LR-）[Posttestoddsnon-BE=pretestoddsnon-BE×(1/LR?)]
灵敏度、特异性、LR+、LR-的95%置信区间（CI）采用上述的方法计算。
结果
所有BE试验样本药物均为不在口腔部位吸收的速释制剂。此外，本次调查仅包含验后statisticpower高于80%的BE不等效试验，因此，点估值在BE试验界限以外的BE不等效试验假设为BIE；换而言之，BE不等效结果是因为试验药物和参比制剂的差异造成的。
114个药物中107种药物按照BCS和BDDCS分类，代表的95%样本试验药物（475）。Figure1为BCS和BDDCS每个类别的取样药物分布。
Figure1.DistributionofdrugssampledbetweenBCSandBDDCSclasses.
强代谢型药物是指代谢率高于70%的药物，而弱代谢型药物是指代谢率低于临界值的药物。亲油性药物中，66个强代谢型药物代谢率高于美托洛尔，23个弱代谢型药物代谢率低于美托洛尔。相反，有9种药物表现出良好的亲油性，代谢率高于70%，但其clogP低于美托洛尔，因此也被分为弱代谢型药物。多位专家指出，产生这种不一一对应原因，主要是肝细胞内代谢酶的差异或基于转运或载体转运的药物吸收机制优势造成的
在两种分类系统的所有类类别，Cmax和AUC0–t均出现BE不等效结果。BE不等效发生率为10%（Ⅲ类）-40%（Ⅱ类）。BCS和BDDCS所有分类中都出现BIE结果。（详见Table2）
Table3为BCS或BDDCS每个类别出现BE不等效或BIE风险的比较（两两比较）。总结，不管根据BCS还是BDDCS分类，Ⅱ类药物出现BE不等效风险是高溶解药物的2.5-4倍。在所有比较中，statisticpower均高于99%（以OpenEpi2.3.1.版计算）。但是，此次调查无法保证Ⅰ类和Ⅲ类药物比较和包含Ⅳ类药物的任何比较均具有足够的statisticpower（主要是因为在本次取样中BCSⅣ类药物较少，仅为2.8%）。由于涉及BCS或BDDCSⅣ类药物的比较不具备statisticpower，涉及此类药物的试验将排除在以下分析之外。
对于所有BCS和BDDCS每个类别药物，在单一试验条件下，采用药典或已验证的方法进行体外溶出曲线的测定，并评估的BE结果对体外溶出曲线的预测性。抽取的475个样本药物中29个体外溶出曲线的对比数据；因此，灵敏度、特异性、LR+、LR-和验后概率等诊断参数分别以432个BCS和417个BDDCS的Ⅰ-Ⅲ类药物作统计（详见table4和table5）
在BCS或BDDCSⅠ类仿制药中，体外溶出曲线相似的药物BE等效可能性大概是BE不等效1.7倍，而且当试验药品的体外溶出曲线与参比药物相似时，BE等效成功率会增加到90。同时，高溶解药物进行体外溶出试验后，BE不等效的结果可预测性也会明显提高。体外溶出曲线不相似，BCSⅠ或Ⅲ类药物non-BE结果的验后概率比相对验前概率高4.5或2.5倍。
相反，Ⅱ类药物的体外溶出试验对判断BE等效或BE不等效结果没有任何价值,因为LR+和LR-无显著性差异。
讨论
BCS和BDDCS分类中的BE不等效结果分布：2类最高
BE不等效结果在BCS类型的发生率（详见Figure1和Table2）与之前的报告相似。BE不等效结果发生率最高的是低溶解、高渗透药物。该结果属预料之中，因为根据BCS理论，Ⅱ类药物的吸收是由体内药物溶解或其溶解度（如高剂量药物灰黄霉素的例子）限制的，这意味着是药物性质而非胃排空时间或肠道渗透性决定药物的吸收。
BCS/BDDCS每个类别的BE不等效占比很相似，即使这两个系统采用不同的临界值区分药物吸收程度：BCS为吸收大于90%，BDCCS为大于70%。实际上，在某些情况下药物的代谢率甚至低于给药剂量的70%，因为BDCCS的代谢标准没有把代谢过程限制为氧化酶（第1阶段）和聚合酶（第2阶段）的催化反应，这些反应只是发生在药物吸收后，而很多药物可被细菌酶系代谢，发生首过效应。
BCS和BDDCS每个类别的BE不等效风险：1,3类相当
当比较BCS或BDDCSⅠ和Ⅲ类药物时，出现BE不等效和BIE的结果的风险几乎一致。然而，值得一提的是，由于无法得足够的样本量，本次分析的二类误差相对较高（近70%，H0:μclass1=μclass3）。相反，与高溶解药物相比，低溶解、高吸收药物出现BE不等效或BIE风险高出将近4倍（详见Table3）。由于两组对照药物（两个系统的Ⅰ或Ⅲ类vsⅡ类）的预计风险相似，所以溶解度比吸收程度对BE结果的影响更大。以上结果有助于评估生物等效豁免的范围不限于BCSⅠ类药物，正如Polli等人的建议。
然而，上述分析的潜在缺点在于BCS分类基于以假定值作为渗透性的测定方法。假定值作为渗透性分类并未被任何生物等效豁免指导原则作为渗透性分类的标准或甚至为支持条件。所以暂时基于溶解度和假定值的BCS分类可能会大致假阴性结果（如渗透性评估相关的药物底物吸收案例）。相反，亲油性和肠道渗透性有相当紧密的关联，至少对于主要通过被动吸收的药物。
体外溶出试验对BE结果可预测性-高溶解药物的诊断参数
考虑到体外溶出曲线和BE试验的对比结果有差异，可能需要在2*2列联表中进行比较。试验表现指标源于评估体外试验和体内试验结果可预测性的表格（Table1和Table5）。
在体外溶出实验中，单个类别的灵敏度明显高于所有BCS或BDDCS类型，75%-96%的BE药物的体外溶出曲线与其参比药物相似，然而BCS和BDDCSⅠ和Ⅲ类药物的特异性在统计数据上并不显著。换而言之，50%的BE不等效药物的体外溶出曲线不相似，而另外50%的体外结果相似。然而，基于BCS的生物等效需要的是不止一条而是一组三条在PH与上消化道相似的条件下得出的体外溶出曲线，这可以被理解为一系列分析试验，因为第一个结果决定第二个试验是否进行。例如：如果体外溶出曲线在PH1.2时相似，那么第二个体外溶出试验就在PH4.5的条件下进行，如果也相似，第三个试验就在PH6.8的条件下进行。根据生物等效豁免过程，只有三个体外溶出曲线都相似，药物才能被批准，否则判定无效。这种多重检验结合可能会导致整体特异性比单个体外试验更高。考虑到本次调研的诊断参数以单个体外试验结果计算，溶出试验在药典或生产验证的条件下评估质量控制，当进行支持生物等效豁免的整套体外溶出曲线试验时，试验准确性越高似乎越安全。
BCSⅢ类药物的吸收比Ⅰ类药物更复杂，因为它的吸收部分依赖于小肠，并由摄取性运载体传递。因此，Ⅲ类药物的吸收更受部分辅料影响，与胃肠蠕动相互作用，降低肠转送时间，还可能与摄取性运载体相互作用。由于巴西法律不要求仿制药和参比制剂的处方质与量的相似，因此仿制药的辅料和用量一般有差异。由于500个样本药物的处方与参比制剂处方未做比较，我们无法排除仿制药不同辅料影响膜载体或肠胃蠕动的可能，导致体外溶出试验无法预测的BE不等效结果。这可能解释了Ⅲ类药物的预后概率低于Ⅰ类药物（27%vs71%）。这个观点需要更多的试验来进一步证明。然而，由于Ⅲ类药物出现BE不等效结果的风险较低，因此，根据EMA指南，在辅料成分与参比制剂相同的情况下，BE豁免范围放宽至高溶解、低吸收仿制药是相对安全的。
BSCⅢ类药物生物等效豁免的快速溶出vs非常快速溶出
BSCⅢ类药物的判定指标采用两个溶出标准计算，快速溶出（30分钟内，Q>85，f2相似）vs非常快速溶出（15分钟，Q>85，无需f2）。由于两种溶出标准的判定参数95%置信区间几乎完全重合（详见Table5），BE结果的体外溶出曲线可预测性并没有因采用更严格的溶出标准而提高。而且，这种方法增加了假阴性结果的可能性（1-灵敏度，从8%增至25%），降低了non-BE结果的验后概率（从27%降至22%）。之前的报告已经说明生物等效豁免的标准对于非常快速溶的BSCⅢ类口服药物制剂过于保守。
体外溶出试验对BE结果可预测性--Ⅱ类药物的诊断参数
Ⅱ类药物体外试验呈假阳性结果的可能性将近90%，显示特异性90%置信区间有显著的统计意义，意味着药典溶出方法不是生物相关的。此外，由于95%置信区间具有统一性，LR+和LR-缺乏诊断价值，因此，验后概率等于验前概率；换而言之，根据药典的方法测得的用体外溶出曲线对BE结果预测性与BE等效或BE不等效的概率不一致（见Table5）。另外，由于我们没有基于BCS生物等效豁免指南获得这些药物（BCSⅡ类）体外溶出曲线，因此它们的可预测性暂无结论。
高渗透弱酸性药物的诊断指标在PH6.8条件下表现出高溶解度
由于WHO建议基于BCS的生物等效豁免范围放宽至PH6.8条件下高溶解、快速溶出的Ⅱ类药物，我们还利用在中性条件（磷酸盐缓冲液低于PH6.8-7.5）下的22个药物的体外溶出曲线作为计算判定指标，分析了8个BE不等效和14个BE等效药物，其中包括5个pKa小于5.5的弱酸性药物且剂量低于PH6.8-7.4条件下的剂量。然而，这些诊断参数被证明并非不同于BSCⅡ类药物计算所得值，根据之前布洛芬的药物报告显示：中性条件下的的溶出试验一方面不能分辨出吸收率的差异，另一方面在体内等效案例过分区分。事实上，弱酸性药物在胃里溶出或许能区分Cmax在体内的差异，但药物溶出低排除了f2数据的统计。最近，一些专家建议使用f2数据之前将数据扩大到参比制剂的100%释放（由于f2代表绝对差异而非相对差异）。然而，这个领域的讨论才刚开始，高渗透弱酸性药物溶出数据处理的最佳方式仍需达成一致。
结论
通过现况调查，我们发现溶解性对BE结果的影响远大于药物吸收程度，无论是肠道渗透性还是药物代谢程度。同时，由于两个系统的Ⅰ、Ⅲ类与Ⅱ类对比的评估风险相似，因此BDDCS被认为等同于BCS作为生物豁免的药品分类系统。在一些案例中，药物代谢数据比渗透性数据更易获取；用作监管目的的两种药品分类方法都是有效的。而且，由于Ⅲ类药物出现BE不等效或BIE的风险一般较低，生物豁免范围放宽至高溶解、低吸收的仿制药可能是安全的，只要它们采用与参比制剂相同且等量的辅料进行制备。相反，Ⅱ类药物由于出现BE不等效或BIE的风险较高，且LR+和LR-在体外溶出试验的质量控制中缺少借鉴作用，故生物等效豁免放宽Ⅱ类药物到仍待考证。
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