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论文ID
实验设计
实验结果
1. 补充Goji可改善酒精性肝损伤
为了评估Goji对急性酒精摄入引起肝损伤的保护作用，我们用1%和2%Goji饮食和阳性对照药物联苯双酯进行了为期14天的干预。如血清中较低的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平所示，我们发现1%和2%Goji饮食和联苯双酯具有保肝作用，（补充图S1）。基于人类每日适量食用Goji，我们选择了1%的Goji饮食，进一步研究Goji的保肝作用机制。我们发现饮食Goji干预14天显著降低血清ALT和AST水平（p值< 0.05）（图1A-C）。在用酒精处理的小鼠中，苏木精-伊红染色的肝脏切片上的炎症细胞浸润增加，但被Goji所缓解（图1D）。与对照（CTRL）小鼠相比，酒精处理(ALD)小鼠肝脏中的LPS含量增加。但与ALD小鼠相比，Goji小鼠的LPS水平低于4.607 ± 0.1326 EU/L（p 值< 0.05）（图 1E）。此外，与CTRL小鼠相比，ALD小鼠肝脏中的谷胱甘肽(GSH)水平降低，但Goji预处理小鼠的水平显著增加（p值< 0.05）（图1F）。此外，Goji显著降低了促炎细胞因子的水平，例如IL-1β和IL-2，这些细胞因子通过急性酒精处理升高（p值< 0.05）（图1G，H）。Goji组中的其他炎性细胞因子和趋化因子，如IL-3、IL-12、TNF-α、IL-17A和MIP-1α显著低于ALD组（补充图S2）。ALD小鼠血清中IL-4、IL-13、CCL2（MCP-1）和CCL4（MIP-1β）水平也升高，Goji干预呈下降趋势（补充图S2）。这些结果表明，膳食Goji补充可改善肝脏中急性酒精引起的炎症和氧化应激。
图1 膳食Goji可预防小鼠急性酒精引起的肝损伤
(A) 实验设计。(B) 血清中的AST水平。(C)血清中的ALT水平。(D)苏木精和伊红染色的肝脏代表性切片(100×, 200×)。比例尺，50 µm。(E) 肝脏中LPS的浓度。(F)肝脏中GSH的浓度。(G)血清中IL-1β的水平。(H)血清中IL-2的水平。对于B-F，n = 6-8；对于G和H，n = 3–4。数据显示为平均值 ± SEM，统计显著性通过Tukey检验进行多重比较校正的单因素ANOVA评估。*p 值< 0.05。
2. Goji维持上皮细胞完整性并调节短链脂肪酸
饮酒可能会破坏粘液和上皮屏障，并通过肠道衍生的病原体相关分子模式PAMPs（如LPS）的易位引发炎症反应，LPS是一种来自革兰氏阴性菌外膜的内毒素。因为Goji抑制LPS易位至肝脏，我们接下来评估了Goji对肠道屏障的影响。粘液是肠道的第一道屏障，细菌或病原体必须穿透它才能到达上皮细胞。结肠表面杯状细胞不断分泌粘蛋白2（MUC2）并维持粘液层。如图2A所示，与CTRL小鼠相比，ALD小鼠的结肠组织MUC2和杯状细胞数量减少，而我们通过MUC2免疫组织化学和AB-PAS染色测定发现，Goji可维持粘液层。酒精降低了与维持肠道完整性有关的Claudin1的基因表达，而Goji显著提高了其在小鼠结肠组织中的表达（图 2B）。
短链脂肪酸是最丰富的代谢物，由结肠细菌对富含难以消化纤维的饮食进行发酵产生。我们发现，与CTRL小鼠相比，酒精导致盲肠内容物中的SCFA水平较低（图 2C-E）。与ALD组相比，Goji组的乙酸和丁酸盐含量增加（图2C），其中丁酸盐的增加幅度接近2倍（分别为18.63 ± 3.296和7.621 ± 1.262 µmol/g，p值< 0.05；图2D）。此外，与ALD相比，Goji还增加了异戊酸的水平（4.919 ± 1.502，n = 7和1.817 ± 0.4527 µmol/g，n = 6，分别为p值< 0.05；图2E）。这些数据表明，Goji恢复了肠上皮细胞的完整性并维持了肠道中SCFA的水平。
图2 Goji维持肠道微环境并调节肠道微生物群的整体结构
(A) 结肠切片MUC2表达的AB-PAS染色和免疫组化分析。比例尺，100µm。(B) Claudin1在结肠中的相对表达。(C)盲肠乙酸的定量。(D)丁酸的定量。(E)异戊酸的定量。(F)微生物群的香农指数；(G)微生物群的辛普森指数。(H)主坐标分析(PCoA)基于未加权UniFrac距离在D0处绘图。每个点代表每个样本。(I) D14 的PCoA图。(J) D15的PCoA图。F-J，n = 8。数据显示为平均值± SEM，统计显著性通过Tukey检验进行多重比较校正的单因素ANOVA评估。*p 值 < 0.05。
3. Goji改变肠道微生物组成
共生微生物群在预防急性ALD方面具有有益作用。因此，我们进行了16S rRNA基因测序来描述肠道微生物群的整体变化。香农和辛普森指数在第0天(D0)和第14天(D14)小鼠的α多样性没有显著差异。酒精处理后，Goji组的香农和辛普森指数略高于CTRL和ALD组（图2F，G）。基于未加权UniFrac距离的β-多样性主坐标分析(PCoA)反映了Goji改变了小鼠的肠道微生物群结构，尤其是在用Goji处理14天后（图2H-J）。
在D15的进一步比较表明，与CTRL组相比，ALD组的拟杆菌门和变形菌门的相对丰度较高，但厚壁菌门和Epsilonbacteraeota以及放线菌的相对丰度较低。Goji显著逆转了厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门的变化。此外，Goji组中疣微菌的相对丰度显著高于CTRL和ALD组。在科水平上，Goji导致阿克曼氏菌科和双歧杆菌科的丰度增加，但降低了普氏菌科的丰度（补充图 S3B）。在属水平上，Goji显著增加了阿克曼氏菌和瘤胃球菌科_UCG_014的相对丰度，同时降低Alloprevotella的相对丰度。
为了确定三个实验组在酒精暴露前后的差异丰富的分类，我们应用了线性判别分析（LDA）和LEfSe分析（图3A、B；补充图 S4、S5）。LEfSe强调统计意义和生物学相关性。根据LDA评分，双歧杆菌属、乳酸杆菌属、Eubacterium_xylanophilum_group、瘤胃球菌科_UCG_014 和阿克曼氏菌是D14 时Goji组中最富集的属。急性酒精暴露后，Goji组仍富集阿克曼氏菌和Ruminococcaceae_UCG_014。
图3 实验组之间显著差异的分类群和代谢功能预测
(A)在Goji预处理14天(D14)后，处理LEfSe分类分支图以识别不同水平的特定分类群。(B) D15酒精休克后CTRL组、ALD组和Goji组的特异性类群。显著区分的分类单元节点被着色，分支区域根据分类单元的效应大小被着色。绿色表示CTRL组中富集的分类群；红色表示ALD组富集的类群；蓝色表示Goji组中富集的类群。仅显示LDA分数>3的分类单元。黄色表示没有显著差异的物种。前缀表示每个分类单元的分类等级的缩写，包括门(p)、纲(c)、目(o)、科(f)和属(g)。(C) 阿克曼氏菌的相对丰度。(D) 瘤胃球菌科_UCG_014 的相对丰度。数据显示为平均值± SEM (n = 7–8)，并且通过Tukey检验对多重比较进行校正的单因素ANOVA评估的统计显著性。(E) ALD和Goji在第15天代谢途径的显著差异。使用Welch检验计算P值。(F) 肝脏相关指数与显著不同属的相对丰度之间的Spearman相关性。刻度代表相关系数。*p 值 < 0.05，**p 值< 0.01。
4. Goji改变肠道微生物功能
肠道微生物群在宿主体内承担着重要的生理功能。功能基因对于赋予微生物的代谢表型很重要，从而导致复杂的生态相互作用。我们进一步执行Tax4Fun分析，以预测D15的功能靶点。与ALD组相比，Goji组的LPS生物合成减少。此外，在京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析中，Goji上调其他聚糖降解、碳水化合物消化和吸收以及N-聚糖生物合成（图3E）。
此外，我们通过Spearman秩相关分析将肝损伤相关参数与ALD和Goji组之间的20个差异属（相对丰度> 0.1%）相关联（图3F）。其中，阿克曼氏菌和Ruminococcaceae_UCG_014与GSH含量（r = 0.49，p值 < 0.05；r = 0.68，p 值 < 0.01）呈正相关，与AST（r = -0.03，p值 = 0. 9；r = -0.07，p 值 = 0.73）、ALT（r = -0.24，p 值 = 0.31；r = 0.005，p值 = 0.98）呈负相关。虽然Alloprevotella 和 f_Desulfovibrionaceae_unclassified与LPS呈显著正相关，但与GSH含量呈负相关（图3F）。
5. Goji的肠道菌群预防急性酒精性肝损伤
为了确定肠道微生物群是否可能有助于Goji的保肝作用，我们进行了抗生素（ABX）处理和粪群移植（FMT）。如图4A所示，我们在整个实验过程中用ABX处理小鼠。我们发现Goji的肝脏保护作用随着肠道微生物的消除而消失（图 4B-D）。
为了进一步确定Goji调节的肠道微生物群结构是否可能对肝脏保护起因果作用，我们进行了FMT实验。我们发现，与酒精处理后移植CTRL菌群的小鼠相比，移植了Goji菌群的小鼠血清中ALT和AST水平显著降低（p值< 0.05）（图4E-G），并且肝脏的炎症在FMT-Goji中得到缓解（补充图 S6A）。与FMT-CTRL和FMT-ALD组相比，FMT-Goji显著增加肝脏中的GSH含量（p值 < 0.05）（图 4H）。与FMT-ALD组相比，FMT-Goji组导致盲肠中丁酸增加1.69倍（p值 < 0.05）（图4I）。FMT-ALD和FMT-Goji组之间的乙酸和丙酸水平没有显著差异（补充图 S6B，C）。此外，与FMT-CTRL和FMT-ALD组相比，FMT-Goji 组中阿克曼氏菌的相对丰度更高（p 值 < 0.05）（图 4J）。FMT-Goji中瘤胃球菌科的相对丰度高于FMT-CTRL和FMT-ALD 组（补充图 S6D）。LEfSe分析显示瘤胃梭菌属和阿克曼氏菌属是FMT-Goji小鼠的生物标志物（图4K）。这些数据表明，Goji的肝脏保护能力可以通过粪便微生物群转移。此外，Goji需要肠道微生物群来增加肝脏中的内源性GSH以保护其功能。
图4 Goji的肝脏保护作用取决于肠道菌群
(A) ABX处理实验设计。(B)血清中ALT的含量。(C)血清中AST的含量。(D)肝组织中GSH的含量。(E)实验设计。通过抗生素预处理将CTRL组的粪便样本移植到伪无菌小鼠体内，并分为FMT-CTRL组和FMT-ALD组。FMT-Goji 组移植了Goji预处理小鼠的粪便样本。FMT-ALD和FMT-Goji组都被灌胃酒精以诱导酒精肝损伤。(F)血清中ALT的含量。(G)血清中AST的含量。(H)肝组织中GSH的含量。(I)盲肠丁酸的定量。(J) 阿克曼氏菌的相对丰度。(K) 通过LEfSe分析进行分析FMT-ALD和FMT-Goji组之间有显著差异的分类群。数据显示为平均值± SEM，统计显著性通过Tukey检验进行多重比较校正的单因素ANOVA评估。*p值< 0.05。
6. Goji和Goji调节的肠道菌群改变代谢概况
细菌代谢物以多种方式影响宿主。为了研究饮食Goji和Goji影响的肠道微生物群对代谢物谱的影响，我们以非靶向方式分析了盲肠内容物的代谢物。OPLS-DA分析显示，不同组的盲肠内容物样本可以在很大程度上彼此分离（图5A，B）。通过使用p-value < 0.05和VIP > 1的阈值，我们鉴定了Goji和ALD，以及FMT-Goji和FMT-ALD之间的差异表达代谢物(DEMs)（图5C）。基于Venn分析，与ALD和FMT-ALD相比，Goji和FMT-Goji中16种代谢物上调，2种代谢物下调（补充表S3；p值 <0.05）。这18种代谢物强度的热图如图5D所示。在这些代谢物中，与ALD和FMT-ALD相比，(R)-10-羟基硬脂酸酯和苯乙酰谷氨酰胺在Goji和FMT-Goji中的表达下调。L-谷氨酸、焦谷氨酸、retinoyl β-葡萄糖醛酸、香草酸、白屈菜红碱、D-葡萄糖醛酸、2-氧代精氨酸、酮亮氨酸、12,13-DHOME、16-氧代棕榈酸酯、N乙酰-L-2-氨基-6-氧庚二酸、N-甲基-D-天冬氨酸和双半乳糖醛酸在Goji和FMT-Goji中显著逆转。
为了探索肠道微生物群和代谢物的共同调节之间的关系，我们进行Pearson 相关分析并获得相关系数网络（图 5E；补充表 S4）。属于阿克曼氏菌的ASV_3301和ASV_1067与白屈菜玉红碱呈正相关。ASV_3301也与谷氨酸呈正相关。
此外，我们在Goji和ALD以及FMT-Goji和FMT-ALD之间基于DEMs进行了KEGG分析，其前15个显著差异KEGG通路如图5F、G所示。我们发现Goji和FMT-Goji都调节GSH代谢。我们进一步计算了基于最大基团中心度（MCC）的关键代谢物网络。Goji中主要上调的中枢代谢物是 (2R,3R)-3- methylornithinyl-N6-赖氨酸吲哚、L-色氨酸、1H-吲哚-3-甲醛、吲哚乙酸和血清素（图5H）。FMT-Goji中主要上调的关键代谢物是retinoyl β-葡糖苷酸、2,3-dinor-8-iso 前列腺素 F1α、3- geranylgeranylindole、茉莉酸、蓼二醛、脂氧素A4和12-酮基白三烯B4（图5I）。这些数据表明，肠道微生物和宿主产生的代谢物可能在Goji的保肝功能中起调节作用。
图5 Goji vs. ALD和FMT-Goji vs. FMT-ALD小鼠的代谢模式
(A) Goji与ALD的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。(B) FMT-Goji与FMT-ALD的OPLS-DA。(C) Goji与ALD以及FMT-Goji与FMT-ALD之间差异代谢物的维恩图。(D) 与ALD和FMT-ALD组相比，Goji和FMT-Goji组中16种上调和2种下调代谢物的热图。(E)代谢物和ASV的相关网络。(F)基于Goji与ALD中差异代谢物的KEGG富集途径。(G) 基于FMT-Goji与FMT-ALD中差异代谢物的KEGG富集途径。(H) Goji和ALD之间DEMs关键网络中的10种代谢物。(I) Goji和ALD之间DEMs关键网络中的10种代谢物。
讨论
肠道和肝脏之间的串扰被认为是酒精引起肝病的重要决定因素。因此，此过程改善需要调节肠道微生物群落和代谢物，其中，SCFAs等代谢物可以为结肠细胞提供能量物质并缓解肠道炎症。饮食是快速改变肠道微环境的一种简单有效的方法。此外，鉴于肠道微生物群的作用，FMT已在酒精相关肝病中进行了许多应用研究。Goji因其多种功能活性而被广泛研究，其保护作用是否与肠道菌群相关引起了更多关注。在这里，在饮食中提供Goji，作为成人每天约13-20克的模拟量。我们的研究发现，Goji可以调节肠道菌群组成并丰富产丁酸盐的细菌，例如阿克曼氏菌和Ruminococcaceae_UCG_014。补充Goji还能保持结肠黏液的完整性，并抑制LPS在酒精作用下通过门静脉侵入肝组织。随后，急性酒精处理后血清转氨酶和促炎细胞因子升高的水平被Goji所降低。补充Goji后，肝组织中抗氧化GSH的水平增加。此外，我们使用ABX和FMT阐明肠道微生物群是Goji预防急性酒精摄入引起肝损伤的关键因素。
16S rRNA基因测序结果显示，在一次急性大规模灌胃酒精之后，Goji处理组与未处理组肠道菌群结构存在显著差异。先前的研究已经证实，酒精摄入量与内毒素产生菌的增加呈正相关，而与SCFAs产生菌减少呈负相关。在这里，我们发现14天后的Goji饮食干预显著改变了小鼠肠道微生物群的群落结构。我们的研究证实了在酒精处理后与内毒素产生菌相关的肠杆菌科菌相对丰度增加。在我们的研究中，与ALD组相比，Goji中的厚壁菌门（包含许多SCFAs产生菌）和其他SCFAs产生菌（如毛螺菌科、阿克曼氏菌属、Ruminococcaceae_UCG_005、Ruminococcaceae_UCG_014、Ruminiclostridium_5和Christensenellaceae_R-7_group）的丰度更高。SCFAs是潜在的代谢候选物，可以解释Goji的影响。先前的一项研究表明，与健康对照组相比，酒精性脂肪性肝炎(ASH)患者的粪便A. muciniphila（与肝病严重程度间接相关）丰度减少。在ALD小鼠模型中，移植A. muciniphila可以防止酒精引起的肠道渗漏、增加粘液厚度和紧密连接蛋白的表达。此外，阿克曼菌能够产生一种菌毛样蛋白，可增强肠道粘膜的免疫稳态以及肠道屏障功能。最近的研究表明，已知Goji的几种物质会增加阿克曼菌的丰度，例如多糖和2-O-β-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸。
据报道，饮酒会改变微生物代谢物，例如SCFAs。Goji多糖已被证明可提高SCFAs的浓度。在这项研究中，我们发现预防性Goji在酒精处理下都增加了异戊酸和丁酸的水平。用Goji预处理的粪便移植到小鼠身上也可以防止酒精刺激下丁酸减少。丁酸盐被认为可通过调节紧密连接蛋白和粘蛋白的表达来维持肠道屏障完整性。酒精可诱导粘液糖蛋白的糖基化改变，并可能导致粘液保护和粘附功能的失衡以及肠道屏障的破坏。AB-PAS和MUC2染色结果表明Goji可以维持粘液的完整性。
对于功能分析，与ALD组相比，Goji组的LPS生物合成代谢下调。酒精性肝损伤的发病机制复杂，不仅是酒精及其代谢产物对细胞的直接毒性作用所致，其他因素也在其发病机制中起重要作用，如损害脂质代谢，加剧炎症反应，诱发纤维化。此外，微生物产物和代谢物也与酒精相关的肝病相关，包括胆汁酸、吲哚-3-乙酸、丁酸、长链脂肪酸、溶细胞素、β-葡聚糖和内毒素。如在啮齿动物中观察到的，LPS生物合成潜力增加可能与脂肪变性中革兰氏阴性变形杆菌的增加相一致。在这项研究中，我们发现Goji组的变形菌门明显低于ALD和CTRL组。
我们发现Goji处理小鼠的粪便移植可以保护受体小鼠的酒精性肝损伤。与FMT-CTRL和FMT-ALD小鼠相比，FMT-Goji小鼠肝组织中的GSH水平也更高。GSH是肝细胞中的主要内源性抗氧化剂，阻断GSH释放可延迟或抑制细胞凋亡。结合ABX实验，我们的研究表明，Goji促进了肝脏中GSH的合成，这依赖于肠道微生物群。FMT-Goji组中也富集了阿克曼氏菌的丰度。基于这些结果，Goji的保肝作用可能是通过促进阿克曼氏菌的生长来实现的。
盲肠内容物的代谢特征表明，（R）-10-羟基硬脂酸（油酸形成的底物）和与肝损伤相关的苯乙酰谷氨酰胺均被Goji和Goji调节的微生物群下调。Goji和Goji调节的微生物群显著增加了与抗氧化和抗炎相关的果胶代谢产物和香草酸的二半乳糖醛酸含量。在代谢物的关键网络中，我们发现Goji调节了色氨酸代谢中的一些代谢物，并显著提高了作为芳烃受体 (AhR) 配体的吲哚和吲哚乙酸的水平。AhR 的激活通常会减少小鼠的炎症并维持肠道稳态。在FMT-Goji中，促成代谢物相关网络的关键点是retinoyl β-葡萄糖苷酸。retinoyl β-葡萄糖苷酸，一种视黄酸类视黄酮，被Goji及其调节的菌群所上调。它是一种天然存在的、具有生物活性的维生素A代谢物。视黄醇对于维持上皮和粘膜的完整性至关重要。先前的研究表明，共生细菌产生的视黄醇衍生物可以保护肠上皮屏障。此外，Goji及其调节的微生物群还上调了参与GSH代谢的L-谷氨酸和焦谷氨酸的水平。预测肠道菌群的代谢功能，可以让我们更深入地了解肠道菌群与宿主的共代谢，进一步阐明Goji的作用机制。
动物实验设计有一些局限性。酗酒是肝病的危险因素。研究者们已经采用了多种动物模型来研究暴饮的影响，包括单次暴饮、间歇性重复暴饮和慢性酒精暴露后的暴饮。单一酒精处理已被用于研究酒精性肝损伤急性发病的机制。小鼠单次酗酒表现为早期急性酒精性肝损伤，Goji对不同阶段酒精性肝损伤的保护作用仍有待进一步研究。这项研究的另一个局限是肠道微生物如何影响内源性肝脏GSH合成尚未得到充分解释，以及Goji的成分/化合物如何精确调节肠道微生物群需要进一步研究。我们也期待通过人体试验更好地研究Goji在塑造微生物生态系统中的作用。
结论
我们的研究结果表明，Goji具有肝脏保护作用，可在酗酒的情况下减轻炎症并提高抗氧化能力。Goji还通过塑造肠道微生物群落来维持小鼠的肠道屏障，尤其是增强阿克曼氏菌。Goji及其调节的微生物群可以显著减少苯乙酰谷氨酰胺等有毒代谢物，并显著增加结肠SCFA、L-谷氨酸、焦谷氨酸、香草酸和retinoyl β-葡萄糖苷酸。此外，Goji调制的谷胱甘肽与微生物有关。
Goji可以通过改善肠道菌群功能障碍和代谢物来恢复肠道菌群稳态。此外，这项研究表明，多组学的联合应用可能是发现益生元食物药理机制的重要策略。
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