朋友们~本周CRISPR/Cas技术再次迎来重大突破！
我们知道，CRISPR/Cas技术虽然已在短短几年内成为目前最好用的基因编辑工具之一，但是实际上它的应用还要受到特定基因序列的限制，这就意味着它并不能够随我们所欲地编辑所有的基因片段。
而一项最新的研究则完全放开了CRISPR/Cas的束缚，现在“基因魔剪”可以说是真的“想剪哪里剪哪里啦”！
这项新研究提出了两种人工改造的Cas酶，SpG和SpRY，其中SpRY几乎可以不受限制地对全部序列具有编辑活性。这意味着我们能够对以前根本无法涉及的致病突变进行修改，基因编辑能为人类做的贡献大大增加了[1]！这项研究发表在《科学》杂志上，通讯作者是来自麻省总医院的Benjamin P. Kleinstiver。
图源 | pixabay
我们都知道，CRISPR/Cas系统原本是原核生物的一种自我保卫机制，CRISPR/Cas的存在能够让原核生物避免外源遗传物质的入侵。除了作为识别重点的CRISPR序列，其实还有另外一个重要的序列，原间隔序列临近基序（PAM）。简单来说，没有对应的PAM，就启动不了CRISPR/Cas系统。
PAM根据Cas酶的种类不同而有所不同，目前使用最广泛的、来自化脓链球菌的SpCas9，主要识别的是NGG序列。
很显然，仅能识别NGG是不足以满足对所有序列编辑的需求的。
对蛋白来说，结构决定功能。SpCas9识别NGG，主要是通过R1333和R1335两个位置氨基酸侧链和鸟嘌呤的结合[2]，那么我们是不是可以通过替换氨基酸来让SpCas9识别其他的PAM序列呢？
关键在R1333和R1335
其实已经有很多科学家尝试过利用分子进化的方法，改变PAM作用域中的氨基酸来改变Cas酶的PAM偏好。比如我们之前也介绍过的刘如谦的xCas9，就是通过噬菌体辅助持续进化器（PACE）来制造大批量的突变，从中筛选出PAM适应更广的Cas酶。
顺便一提，xCas9的战绩是适用性扩大了4倍。
而今天介绍的研究，则是采用了另一种思路，结构导向工程（structure-guided engineering），精确地对个别氨基酸序列进行替换，以获得想要的蛋白性状。
为了一步步扩大SpCas9的PAM适用范围，研究者们决定先搞出一个能够识别NGN的1.0版本来。
科研经验告诉学者们，识别PAM的关键就在于某个或某几个氨基酸残基[3]。通过比对SpCas9-VQR、SpCas9-VRQR等前人开发的变体和它们识别的PAM序列，研究者们很快提出了几个可能的氨基酸取代方案。为了测试这些变体的活性，研究者们还开发了一种高通量测试PAM活性的方法（HT-PAMDA）来分析变体对PAM的偏好。
最终，在各种氨基酸取代组合方案里，研究者们获得了一种能够基本等效识别NGA、NGC、 NGG、NGT的变体，它具有五个氨基酸取代（D1135L/S1136W/G1218K/E1219Q/R1335Q/T1337R），被命名为SpG。
通过在人类细胞中进行的编辑测试，我们可以看到，SpG对NGN可实现基本等效识别，且效率要比SpCas9以及其他的变体更高。进一步实验显示，SpG对NGG的编辑活性达到51.2%，其他三类则达到了53.7%。
此外，SpG也适用于单碱基编辑器（BE）。
SpG可识别NGN，且活性更高
好，接下来继续扩大PAM范围。搞定了NGN，现在把NAN也加上，试试NRN（R即A+G）。
这一次，研究者们瞄准的是R1333位可能与腺嘌呤产生的化学反应。HT-PAMDA测试出来的结果显示，把R1333位置替换成丙氨酸、半胱氨酸或脯氨酸就可以有效识别NRN了。
经过一系列细化和筛选，最终研究者们得到的是在SpG（L1111R/A1322R）基础上，增加R1333P、A61R、N1317R的2.0版，SpRY。
为什么叫SpRY呢？
虽然在NGN上，SpRY活性不如SpG，不过SpRY同样能够有效识别NAN，NRN成立。比较惊喜的是，SpRY同样能够识别NYN（Y即C+T）。在实验中，全部31个NYN位点，SpRY编辑效率高于20%的有13个（42%），当然，普通的SpCas9是一个也做不到的。
鉴于对NRN的识别活性比NYN更高，大约是一倍，SpRY就叫做SpRY了。
与SpG同样，SpRY也适用于单碱基编辑。
SpRY可识别几乎全部PAM
不言而喻，SpG和SpRY大大扩大了CRISPR/Cas系统的极限，几乎整个基因组都“触手可及”了！
另外，根据实验数据，SpG和SpRY的脱靶效应与SpCas9水平接近，新增的脱靶问题主要来源于扩展大的PAM范围，而另外一种HF1变体则能够消除这类脱靶并提升编辑效率。
说不定我们还可以期待一下3.0版本呢！
编辑神叨叨
全体奇点糕呕心沥血呕心沥血呕心沥血打造的重磅音频课程《医学趋势50讲》终于上线了。我们一口气帮你同步了全球医学前沿领域最重磅的进展。只需500分钟，让你彻底搞懂最重磅的医学前沿进展。
课程亮点如下：
1、全面：一网打尽最重磅的医学前沿进展。
在这套《医学趋势50讲》中，我们囊括了免疫治疗、干细胞、微生物、人工智能、二代测序，抗癌新药研发等15个重要的前沿领域，帮你将全球最顶尖的科研成果一举收入囊中。
2、紧跟趋势：帮你无缝同步全球认知。
奇点跨学科专业知识团队，依靠强大的自有数据库系统，每天跟踪全球3000多本医学与生命科学领域的重要期刊，实时把握医学前沿科技最强劲的脉搏。和全球认知同步，你不需要费心费力，我们把全球脉动送到你的耳边。
3、有趣易懂：不用绞尽脑汁，就能理解全球医学顶尖难题。
医学和生命科学领域的论文往往晦涩难懂，再加上语言的隔阂，导致很多人对此望而却步。这一次，我们帮你把艰深晦涩的前沿学术调制成清新爽口的科学小品，让你在享受科学之美的同时，轻轻松松理解医学顶尖难题。和全球最聪明的大脑思考同样的问题，你也可以。
联系客服
