打开APP
未登录
开通VIP,畅享免费电子书等14项超值服
开通VIP
首页
好书
留言交流
下载APP
联系客服
RT-PCR常见问题答疑解惑
SonGohan
>《科研经验谈》
2013.01.11
关注
问 题
可能原因
建议解决方法
RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
RNA被降解
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA
使用良好的无污染技术分离RNA
在将组织从动物体取出后立刻处理
在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。
RNA中包含逆转录抑制剂
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
多糖同RNA共沉淀
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。
起始RNA量不够
增加RNA量。
对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
RNA模板二级结构太多
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。
对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
引物或模板对残余的RNA模板敏感
在PCR前用RNaseH处理
。
靶序列在分析的组织中不表达
尝试其他靶序列或组织
PCR没有起作用
对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物
PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
PCR引物设计较差
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
DNA含有抑制剂
诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
富含GC的模板
对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。
模板浓度太低
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
镁离子浓度太低
从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
退火温度太高
使用公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
引物浓度太低
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
RT-PCR特异性:在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
引物和模板非特异性退火
在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。
GSP设计较差
RNA中沾染了基因组DNA
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
形成引物二聚体
设计在3'端没有互补序列的引物。
引物和模板非特异性退火
以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
镁离子浓度太高
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
因为扩增复杂模板导致引物错误起始
使用巢式PCR或递减PCR。
沾染外源DNA
使用抗气雾剂的吸头和UDG
因为二级结构导致引物结合位点无法接近
对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRx Enhancer Solution。
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
聚合酶忠实性低
使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如Platinum Pfx DNA聚合酶。
循环数太多
降低循环数
。
四种dNTP的浓度不同
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
定量RT-PCR无扩增产量
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
无cDNA合成
cDNA合成温度太高
降低保温温度
反转录cDNA产物被二级结构封闭
提高保温温度。重新设计引物
RNA被损害或降解
荧光探针无功能
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。
必要的话设计和合成探针。
灵敏度低须在比预期更高的循环中检出产物
初始模板RNA不充分
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1μg的总RNA
RNA被损害和降解
必要的话更换RNA
RNAse污染 维持无菌条件;加入RNase抑制剂
无效的cDNA
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
无效的PCR扩增
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺
调整cDNA合成温度或引物设计
信号高于预期在低于预期的循环中即可检出产物
反应中加的样品太多
降低模板的浓度
模板或PCR残余污染
隔离污染来源,更换试剂
使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
电泳后出现意外的条带 RNA
被基因组DNA污染
用DNase I预处理RNA
用于第一链合成的寡聚dT或随机引物
使用基因特异性引物
PCR的低特异性
优化PCR条件
本站仅提供存储服务,所有内容均由用户发布,如发现有害或侵权内容,请
点击举报
。
打开APP,阅读全文并永久保存
查看更多类似文章
猜你喜欢
类似文章
【热】
打开小程序,算一算2024你的财运
RT-PCR实验方法总结
实验篇之RT-PCR
RT
PCR 核酸检测试剂盒 | MedChemExpress
RT-PCR实验操作的注意事项
RT-qPCR 基本原理
更多类似文章 >>
生活服务
热点新闻
留言交流
回顶部
联系我们
分享
收藏
点击这里,查看已保存的文章
导长图
关注
一键复制
下载文章
绑定账号成功
后续可登录账号畅享VIP特权!
如果VIP功能使用有故障,
可点击这里联系客服!
联系客服
微信登录中...
请勿关闭此页面
先别划走!
送你5元优惠券,购买VIP限时立减!
5
元
优惠券
优惠券还有
10:00
过期
马上使用
×