阎敏娜1 项保利2 张素贞1 周素涛1 许玉环1
河北北方学院附属第一医院 1.检验科，2.呼吸科（河北张家口 075000）
摘要：目的 探讨支气管哮喘患儿外周血IL-17、IL-35水平与疾病进展的关系。方法 选取2016年5月—2017年5月间住院的65例新发的支气管哮喘急性发作期患儿为研究对象，根据疾病严重程度分为间歇性支气管哮喘、轻度持续性支气管哮喘、中度持续性支气管哮喘和重度持续性支气管哮喘；同时以20例健康体检儿童为对照组。应用酶联免疫吸附试验检测所有研究对象血清IL-17及IL-35水平，并进行统计学分析。结果 哮喘组IL-17为（49.9±12.5）pg/mL，高于对照组的（34.7±7.2）pg/mL，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-17水平随哮喘严重程度增加而上升，且与肺功能指标FEV1、FVC和FEV1/FVC等呈负相关（P＜0.05）。哮喘组IL-35为（171.2±18.8）pg/mL，低于对照组的（264.2±33.7）pg/mL，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-35水平随哮喘严重程度增加而下降，且与肺功能指标呈正相关（P＜0.05）。分别以IL-17＞42.6 pg/mL和IL-35＜205.8 pg/mL为截断值，均能达到较高的疾病诊断的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值及曲线下面积（AUC）；联合检测两个指标则可进一步提高诊断效果。结论 哮喘儿童血清中IL-17和IL-35水平可以作为评估疾病严重程度的参考，且可能作为儿童哮喘诊断的较好的生物学标志物。
关键词：支气管哮喘；白介素17；白介素35；儿童
儿童支气管哮喘是一种由多种炎症细胞、细胞因子参与的慢性炎症性疾病，其主要发病机制是辅助性T淋巴细胞（helper T cells，Th）1和Th2型细胞因子比例失衡[1]，导致气道慢性炎症，以气管的Ⅰ型变态反应及气道高反应性为主要特征[2]。调节性T淋巴细胞（regulatory T cells，Treg）在支气管哮喘的发生发展过程中发挥重要作用[3]。白介素（interleukin，IL）35属于IL-12家族，能够通过Treg细胞抑制Th17细胞的分化和IL-17的分泌，从而发挥免疫抑制作用[4]。本研究检测支气管哮喘患儿外周血中IL-17、IL-35含量，探讨其与儿童支气管哮喘进展及严重程度的关系。
选取2016年5月—2017年5月于河北北方学院附属第一医院住院的65例支气管哮喘患儿作为研究对象。研究对象入选标准：①年龄＜16岁；②所有患儿均有突发喘息、咳嗽、气促、胸闷等症状，或为原有症状急剧加重的急性发作期哮喘患儿，其诊断符合2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》标准[5]；③排除合并其他慢性疾病者。同时收集同一时间段本院体检中心的20例健康体检儿童为对照组。对照组入选标准：①年龄、性别等基本人口学资料与哮喘儿童匹配；②无哮喘及其他过敏性疾病史；③无哮喘及其他过敏性疾病家族史；④近2周内未使用皮质激素类、免疫抑制剂或其他免疫调节剂、炎症递质拮抗剂；⑤无特殊疾病史，同时排除近2周有上呼吸道感染史者。
根据严重程度将哮喘患儿分为间歇性支气管哮喘（间歇组）、轻度持续性支气管哮喘（轻度持续组）、中度持续性支气管哮喘（中度持续组）和重度持续性支气管哮喘（重度持续组），分级标准参考2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[5]。
本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者在研究开始前签署知情同意书。
1.2.1 样本采集 哮喘患儿于住院第1天清晨，对照组于体检时抽取外周静脉血2 mL，促凝后4 ℃、3 000 r/min、离心半径5.5 cm，离心10 min，分离血清并－80 ℃保存待检。
1.2.2 临床资料收集 收集哮喘患儿主要临床资料，包括性别、年龄、哮喘发作频次与发作时相、哮喘发作严重程度分级判定结果等。
1.2.3 肺功能检测 所有哮喘患儿于入院当天行肺功能检测，检测指标包括第1秒用力呼气量（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）和FEV1/FVC。肺功能检测由专业人士使用CHEST 株式会社 HI-801肺功能仪进行。
1.2.4 血清IL-17、IL-35检测 使用ELISA检测试剂盒检测血清中IL-17、IL-35含量，试剂盒购自上海联科生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明进行操作，终止反应后利用酶标仪检测各个反应孔A450值。
采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验。两变量间相关关系采用 Pearson 检验进行分析。使用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）判定IL-17和IL-35在儿童哮喘诊断中的截断值。以P＜0.05为差异有统计学意义。
哮喘组65例，男35例、女30例，中位年龄7.0（5.0～9.0）岁，身高（138.6±17.2）cm，体质量（31.15±4.17）kg。其中间歇组19例，轻度持续组14例，中度持续组17例，重度持续组15例。对照组20例，男11例、女9例，中位年龄6.5（5.25～7.75）岁，身高（141.2±15.8）cm，体质量（31.78±3.98）kg。
哮喘组与对照组在性别（χ2=0.01，P=0.928）、年龄（Z=0.93，P=0.350）、身高（t=0.61，P=0.549）、体质量（t=0.59，P=0.552）方面差异均无统计学意义，具有可比性。不同严重程度哮喘组基本人口统计资料与健康对照组相比差异也无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
哮喘组IL-17水平为（49.9±12.5）pg/mL，明显高于对照组的（34.7±7.2）pg/mL，两组间差异有统计学意义（t=2.38，P=0.009）；哮喘组IL-35水平（171.2±18.8）pg/mL，低于对照组的（264.2±33.7）pg/mL，两组间差异也有统计学意义（t=3.18，P=0.002）。
对照组和不同严重程度哮喘组之间IL-17、IL-35水平以及主要肺功能指标（FEV 1、FVC和FEV 1/FVC）的差异均有统计学意义（P均＜0.001）；随哮喘严重程度加重IL-17水平不断升高，而IL-35水平以及FEV1、FVC（%）和FEV1/FVC则逐渐降低。见表1。2.3 IL-17和IL-35与主要肺功能指标相关性分析
血清IL-17水平与IL-35、FEV1、FVC和FEV1/FVC均呈负相关（r=－0.770～－0.431），血清IL-35水平与FEV1、FVC和FEV1/FVC均呈正相关（r=0.328～0.797）。见表2。2.4 ROC曲线分析结果
表1 不同组别IL-17、IL-35及主要肺功能检测结果 （±s）
注：1)与对照组比较，P＜0.05；2)与间歇组比较，P＜0.05；3)与轻度持续组比较，P＜0.05；4)与中度持续组比较，P＜0.05
项 目 对照组(n=20) 间歇组(n=19) 轻度持续组(n=14)中度持续组(n=17)重度持续组(n=15) F值 P IL-17/pg·mL－1 34.7±7.2 45.9±11.21) 47.3±11.81) 53.0±14.41)2)3) 60.9±13.61)2)3)4) 37.86 ＜0.001 IL-35/pg·mL－1264.2±33.7 201.8±27.91) 173.7±26.41)2) 135.9±23.01)2)3) 89.6±23.61)2)3)4) 40.12 ＜0.001 FEV1/L 2.48±0.29 2.82±0.311) 2.23±0.351)2) 2.02±0.381)2)3) 1.31±0.261)2)3)4) 23.19 ＜0.001 FVC/% 84.6±5.37 82.2±6.16 79.1±5.421) 73.5±5.801)2)3) 57.7±6.111)2)3)4) 31.54 ＜0.001 FVC/L 2.71± 0.32 3.64±0.281) 3.23±0.471)2) 2.84±0.382)3) 2.65± 0.412)3)4) 10.71 ＜0.001 FEV1/FVC 83.2±4.12 80.1±4.371) 71.9±3.581)2) 69.2±3.091)2)3) 50.3± 4.721)2)3)4) 52.80 ＜0.001
以IL-17＞42.6 pg/mL、IL-35＜205.8 pg/mL为截断值，ROC曲线分析显示，判定儿童哮喘的灵敏度、特异度、准确度、阳/阴性预测值和曲线下面积（area under curve，AUC）均能够达到较高水平。IL-17和IL-35联合检测可以将灵敏度提高到96.2%。见表3。
儿童哮喘发病率高，炎症在疾病进展过程中起关键作用，多种免疫学机制参与其中[6]。Th2细胞优势分化导致相关的促炎细胞因子增多，抑炎因子相对减少，在Th2细胞依赖性气道炎症过程中发挥重要作用[2]。明确相关细胞因子在哮喘炎症调节过程中的相互作用及关系，对疾病的控制与治疗有重要意义。
IL-17是一种由Th17细胞产生的前炎症细胞因子。已有研究表明，IL-17升高与多种慢性炎性疾病有关，如类风湿性关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮及移植排斥反应等[7]。IL-17通过招募中性粒细胞，介导嗜碱性粒细胞和气道上皮细胞的相互作用，参与新生儿哮喘的发生过程[8]。
表2 IL-17和IL-35与主要肺功能指标相关性分析
项 目 IL-17/pg·mL－1 IL-35/pg·mL－1 r值 P r值 P IL-17/pg·mL－1 — — －0.647 ＜0.001 IL-35/pg·mL－1 －0.647 ＜0.001 — —FEV1/L －0.770 ＜0.001 0.797 ＜0.001 FVC/% －0.615 ＜0.001 0.573 ＜0.001 FVC/L －0.654 ＜0.001 0.608 ＜0.001 FEV1/FVC －0.431 0.001 0.328 0.009
IL-35属IL-12家族，只由Treg细胞产生并分泌，与其他IL-12家族成员相比，IL-35具有强烈的抑炎作用。通过抑制Th2相关细胞因子，如IL-17等的产生，限制Th2细胞增殖，从而逆转Th2细胞依赖性气道高反应[9]。有研究表明，在经抗原提呈细胞刺激后，Treg细胞可分泌大量的IL-35，通过对CD4 T细胞的负向调控参与多种自身免疫性疾病和炎症失调性疾病的进展[10]。相关研究显示，Treg细胞主要通过产生IL-35，将Th17细胞阻滞在G1期，而不是诱导细胞凋亡，从而抑制Th17细胞分化和IL-17因子释放来发挥免疫抑制作用[11]。
本研究结果表明，哮喘儿童IL-17明显升高，并随疾病严重程度增加而上升，且与FEV1、FVC和FEV1/FVC等多个肺功能指标呈负相关； IL-35变化趋势与IL-17相反，哮喘儿童IL-35明显降低，随疾病严重程度增加而进一步降低，且与肺功能指标呈正相关。提示血清中IL-17可能通过增强炎症反应而加重疾病进展，IL-35则在抑制气道炎症反应中发挥积极作用，参与气流受限的逆转。研究还显示，IL-17与IL-35呈负相关，也进一步验证了IL-35通过抑制Th17细胞的分化和IL-17因子释放的方式发挥生物学作用，当抗过敏机制不能良好的发挥作用时，可能造成血浆IL-35含量降低，Th2细胞相关的气道反应性发生，IL-17等相关细胞因子产生和分泌增加，从而导致哮喘发生。
本研究进一步分析IL-17和IL-35在儿童哮喘诊断中的价值，结果显示，以IL-17＞42.6 pg/mL、IL-35＜205.8 pg/mL为截断值，能达到诊断哮喘较高的灵敏度、特异度、准确度、阳/阴性预测值及AUC。联合两个指标则可进一步提高诊断效果。
表3 IL-17和IL-35评估儿童哮喘的诊断价值
项 目 灵敏度/% 特异度/% 准确度/% 阳性预测值/% 阴性预测值/% AUC 95% CI IL-17＞42.6 pg/mL 85.6 73.3 81.0 85.1 76.2 0.88 0.77～0.94 IL-35＜205.8 pg/mL 83.9 77.1 81.8 88.3 78.1 0.84 0.78～0.95联合检测 96.2 77.8 89.2 90.8 90.5 0.87 0.75～0.95
综上所述，哮喘儿童血清IL-17和IL-35水平可以作为评估哮喘严重程度的参考指标，且可能作为儿童哮喘诊断较好的生物学标志物。
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Changes and significance of IL-17 and IL-35 levels in bronchial asthma in children
YAN Minna1, XIANG Baoli2,ZHANG Suzhen1, ZHOU Sutao1, XU Yuhuan1 (1. Laboratory Medicine, 2. Department of Respiration, The First Aff i liated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei, China)
Abstract: Objective To explore the relationship between the levels of IL-17 and IL-35 in peripheral blood and progression of bronchial asthma in children and the signif i cance of their detection. Method A total of 65 hospitalized children with acute exacerbation of bronchial asthma from May 2016 to May 2017 were selected as the research object. According to the severity of the disease, those children were divided into intermittent asthma, mild persistent asthma, moderate persistent asthma and severe persistent asthma groups. At the same time, 20 healthy children were taken as the control group. The serum levels of IL-17 and IL-35 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the statistical analysis was performed. Results The IL-17 level in asthma group (49.9±12.5 pg/mL) was higher than that in control group (34.7±7.2 pg/mL), and there was signif i cant difference (P＜0.05). The level of IL-17 increased with the severity of asthma, and was negatively correlated with lung function indexes of FEV1, FVC, and FEV1/FVC (P＜0.05). The IL-35 level in asthma group (171.2±18.8 pg/mL) was lower than that of control group (264.2±33.7 pg/mL), and there was signif i cant difference (P＜0.05). The level of IL-35 decreased with the increase of the severity of asthma, and was positively correlated with the index of lung function (P＜0.05). When IL-17＞42.6 pg/mL and IL-35＜205.8 pg/mL are chosen as cut-off values respectively, both of them can achieve high diagnostic values in sensitivity,specif i city, accuracy, positive predictive value, negative predictive value and area under the curve (AUC). Combination of both can further improve the diagnostic value. Conclusion The levels of L-17 and IL-35 in serum of children with asthma can be used as a reference for assessing the severity of disease, and may be a good biomarker for the diagnosis of childhood asthma.
Key words: bronchial asthma;interleukin-17;interleukin-35;child
doi:10.3969/j.issn.1000-3606.2018.04.008
通信作者：阎敏娜 电子信箱：yanminna1987@163.com
(收稿日期：2017-08-18)
(本文编辑：蔡虹蔚)
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