今天要给大家分享一篇应用GEO/TCGA数据库挖掘CRC早期诊断和良好预后的循环外泌体miRNA生物标志物的策略。文章研究思路主要是在discovery阶段通过对已有TCGA/GEO数据库进行整合分析，从而鉴定出候选循环外泌体miRNA，接着进行了training、validation和external validation实验，通过qRT-PCR、ROC曲线分析、Kaplan-Meier方法确定了循环外泌体miR-27a和miR-130a可作为结直肠癌早期诊断与良好预后的生物标记物。
研究背景
结直肠癌（CRC）是世界范围内最常见的癌症之一，由于诊断时已进入晚期，通常预后都较差。miRNA是肿瘤早期诊断和预后评估最有潜力的分子生物标志物之一。之前大多数关于miRNA生物标志物的研究都集中在组织标本上，有研究表明血清外泌体miRNA可作为人类许多癌症（如CRC）诊断和复发的新型生物标志物。然而，关于循环外泌体miRNA表达谱与CRC诊断及预后的关系仍然不清楚。本研究旨在探讨特异性循环外泌体miRNAs是否可作为CRC早期诊断的生物标志物。
实验方法
在discovery阶段，通过对两个GEO数据集和TCGA数据库进行整合分析，选择候选的循环外泌体miRNAs。在随后的training、validation和external validation阶段，使用qRT-PCR和ROC曲线分析鉴定和验证miRNAs的差异表达和诊断效用。采用Kaplan-Meier方法研究循环外泌体miRNAs的预后。
图1. 四个阶段实验方法
图2. 整体研究路线示意图
研究结果
1、循环外泌体miR-27a和miR-130a作为CRC新型潜在诊断生物标志物（Discovery阶段）
首先，通过GEO数据集（GSE33961）对术后生存时间长（≥5年）或短（＜5年）的CRC患者的miRNA表达进行全面比较分析。在生存时间短的患者中发现了46个上调和5个下调的miRNAs。接下来，进一步在TCGA结肠腺癌[COAD]数据集中验证这些失调的miRNAs。发现只有8个miRNAs显示出一致的结果，与CRC患者预后显著相关。
为了研究循环外泌体miRNA的诊断作用，进一步分析了另一个GEO数据集（GSE39833）。发现与CRC患者预后显著相关的8个miRNAs中，只有miR-27a和miR-130a显著失调。GSE39833的数据显示循环外泌体miR-27a和miR-130a是CRC的新型潜在诊断生物标志物。
2、miR-27a和miR-130a在CRC早期检测中的表现（Training阶段）
接着，对40名I期CRC患者和40名健康受试者进行队列研究，发现I期CRC患者血浆外泌体miR-27a和miR-130a的相对表达显著高于健康对照组。ROC曲线分析表明了血浆外泌体miR-27a和miR-130a在CRC早期检测中的诊断作用。
3、在不同分期CRC患者中进行验证（validation阶段）
然后，通过qRT-PCR检测40名健康受试者、40名I期CRC患者、20名II期CRC患者、14名III期CRC患者和6名IV期CRC患者中miR-27a和miR-130a的表达。发现CRC患者血浆外泌体miR-27a和miR-130a的相对表达显著高于健康对照组。ROC曲线分析验证了血浆外泌体miR-27a和miR-130a可用于不同分期CRC患者的诊断。
4、腺瘤患者的External validation阶段
接下来，进行了由50名I期CRC患者、50名腺瘤患者和50名健康受试者组成的更大队列研究。发现CRC患者血浆外泌体miR-27a和miR-130a的相对表达显著高于腺瘤患者和健康对照组。ROC曲线分析结果进一步验证了循环外泌体miR-27a和miR-130a在CRC早期检测中的作用。
5、循环外泌体miR-27a和miR-130a是肿瘤衍生的miRNAs
为了确定miR-27a和miR-130a是癌细胞分泌进入外周血的分泌miRNAs，对超离心后血浆和培养基样品进行了透射电子显微镜图像（TEM）分析，捕获直径为40-100 nm的圆形微囊泡。然后对收集的15对术前和术后血浆外泌体标本进行qRT-PCR，发现CRC组织切除后循环外泌体miR-27a和miR-130a表达明显下降（图A）。此外，CRC细胞系培养基中的外泌体miR-27a和miR-130a显著更高（图B）。表明了循环外泌体miR-27a和miR-130a来源于肿瘤。
6、血浆外泌体miR-27a和miR-130a的高表达与CRC患者预后不良相关
最后，本研究评估了循环外泌体miR-27a (miR-130a)与CRC患者临床病理特征的相关性。相关回归分析表明，外泌体miR-27a与TNM分期呈正相关，外泌体miR-130a与TNM分期以及组织学分级呈正相关。此外，使用Kaplan-Meier生存分析进一步分析了CRC患者外泌体miR-27a (miR-130a)表达与临床预后的相关性。结果表明，血浆外泌体miR-27a和miR-130a的高表达是总生存率差的新型潜在预测因子。
参考文献：Liu X, Pan B, Sun L, et al. Circulating exosomal miR-27a and miR-130a act as novel diagnostic and prognostic biomarkers of colorectal cancer[J]. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers, 2018, 27(7): 746-754.
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