条件性基因敲入

在条件性基因敲入(conditional knockin)小鼠中，通常通过在启动子后插入LoxP介导的终止子来实现条件性基因敲入，即在敲入基因编码区上游，启动子末端下游设计一个两端带有LoxP元件的终止子。这样的基因敲入小鼠目的基因表达完全受到终止子抑制，直到Cre重组酶出现将终止子剔除后能正常表达。这样我们只要通过控制Cre重组酶的时空特异性表达即可在合适时间地点启动敲入基因的表达。

同样地，对于点突变敲入实验，我们只要同时将LoxP介导的终止子与点突变基因通过传统同源重组打靶ES细胞生产基因敲入小鼠，然后根据实验需要与条件性表达Cre的转基因小鼠杂交，即可实现条件性敲入点突变小鼠模型的构建。在针对浸润性导管胰腺癌的研究中，研究者使用条件性基因敲入的方式获得KrasG12D点突变敲入且以LoxP-stop codon控制表达的小鼠，同时以pdxl启动子特异性控制Cre重组酶转基因小鼠的Cre表达，仅在两种小鼠杂交产生的表达Cre重组酶后代中，有胰腺癌变发生。

除了Cre/LoxP重组系统外，还有许多相似的重组酶系统，如Flp/Frt重组酶系统，不过由于Flp重组酶的最适作用温度是30℃，而Cre为37℃，这就限制了Flp在哺乳动物体内的实用性。不过，我们依然可以在细胞水平上使用Flp/Frt重组体系，因而可以将两种重组系统相结合实现两步法条件性基因敲入和敲除，与传统的3个LoxP组成的小鼠相比有效提高了后期杂交后代阳性几率。最近，突变型优化的Flp酶可以有效地在37℃工作，为基因修饰动物提供了一个很有用的工具(图3-14)。

图3-14 FLP和Cre技术结合的基因敲除技术

同时，随着RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的出现，研究者们也开始利用基因敲入生产RNAi小鼠，但是由于全身范围内的基因敲低(knockdown)对于科学研究来说是难以接受的，所以人们开始寻求Cre/LoxP介导的条件性RNAi。研究者们在RNAi载体的shRNA正反义链间插入 floxed-stop codon，然后通过基因敲入导入ROSA26位点，通过特异性表达的Cre重组酶控制RNAi的组织特异性。也可以向shRNA启动子区插入正筛选基因如flox PGK-neo来阻止shRNA转录的方式实现Cre/LoxP特异性调控shRNA基因敲入小鼠的基因表达。