［摘 要］ 目的: 探讨心理应激状态下咬肌痛觉敏感增高现象与三叉神经脊束核尾侧亚核( Vc) 内星形胶质细胞活化的关系。方法: 健康雄性 SD 大鼠40 只，随机分为: 空白对照组和应激3、7、14 d 组( n =10) ，实验组大鼠经束缚应激相应时间后，采用旷场实验和高架十字迷宫实验观察各组大鼠焦虑、抑郁样情绪; VonFrey 丝刺激检测各组大鼠咬肌的机械性痛阈; 免疫组化染色和 Western－blot 检测 Vc 内星形胶质细胞活化标志物神经胶质酸性蛋白( GFAP) 表达的变化。结果: ①束缚应激 7、14 d 组大鼠在旷场中央停留时间和中央活动总路程，以及在高架十字迷宫开放臂中的滞留时间百分比和进入开放臂次数百分比均较空白对照组明显降低( P ＜0． 05) ; ②束缚应激 7、14 d 组大鼠咬肌机械性痛阈均较空白对照组明显降低( P ＜ 0． 05) ; ③束缚应激 7、14 d 组大鼠 Vc 内 GFAP 的表达阳性率及其蛋白的表达水平均明显高于空白对照组( P ＜ 0． 05) 。结论: 慢性束缚造成的心理应激能导致 Vc 内星形胶质细胞的活化，可能参与了心理应激导致的咬肌痛觉敏感性的增高。
［关键词］心理应激; 痛觉敏感; 三叉神经脊束核尾侧亚核; 星形胶质细胞; GFAP
颌面部咀嚼肌疼痛是颞下颌关节紊乱病最常见的症状之一，与精神心理因素有着密切的关系，本课题组前期研究表明心理应激能够导致大鼠咀嚼肌痛觉敏感性增高。近年来的研究显示，延髓的三叉神经脊束核尾侧亚核( Vc)既是颌面部信息整合的关键核团，又是痛觉信息向中枢传导的第一门户，而中枢神经系统的星形胶质细胞参与了多种类型的疼痛，并与疼痛的恶化和维持密切相关。那么，Vc 内的星形胶质细胞在心理应激致咀嚼肌痛觉敏感的过程中起怎样作用，目前尚不清楚。因此，本实验拟在前期研究基础上，观察星形胶质细胞在心理应激所致咀嚼肌疼痛过程中的表达，为进一步探讨心理应激后口颌面疼痛的中枢机制奠定实验基础。
1 材料和方法
1． 1 主要材料和设备
雄性 Sprague－Dawley 大鼠( 实验动物中心提供) ; 自制束缚器; XR-XZ301旷场实验箱、XR-XG201高架十字迷宫 ( 上海欣软信息科技有限公司) ; BCA 蛋白定量试剂盒( 上海西唐生物科技有限公司) ; 鼠单抗 GFAP、DAB 显色剂、ECL 发光液( Abcam 公司，英国) ; 发光仪( Bio－Ｒad公司，美国) 。
1． 2 心理应激动物模型的建立
取体质量( 200 ～220) g SD 大鼠 40 只，随机分为 1 个空白对照组和束缚应激 3、7、14 d 3 个实验组，每组 10 只。然后参照文献报道的方法对 3个实验组大鼠分别进行束缚应激处理 3、7、14 d，每天9 ∶ 00 ～17 ∶ 00 共8 h，应激期间大鼠禁食禁水; 空白对照组大鼠不做任何处理。整个实验期间所有大鼠均在室温( 22 ±2) ℃条件下进行饲养，每天光照 12 h，自由饮水、进食。
1． 3 行为学测试
应激结束后分别采用旷场实验和高架十字迷宫实验对各组大鼠的行为学进行测试。每组实验完成后均彻底清理实验箱，并喷洒 750 mL/L 乙醇以消除大鼠残留的气味。
旷场实验和高架十字迷宫实验是评价大鼠高级脑功能的重要实验。正常情况下，大鼠多倾向于沿着旷场的边缘活动，但由于好奇心的驱使，大鼠又会向旷场中央进行探索; 同样在高架十字迷宫实验中，大鼠趋向于躲避在闭合臂，但也有向开放臂探索的情况。大鼠在旷场中央停留时间减少或进入开臂次数减少或在开臂滞留时间缩短，即表明其出现了抑郁、焦虑等行为学异常的表现。
1． 3． 1 旷场实验 ( Open field test)
分别于实验第 3、7、14 d 取各组大鼠放置于旷场实验箱( 规格为 100 cm ×100 cm × 80 cm) 的隔音房内，并用弱光照明; 待大鼠适应环境 5 min 后，将其放入旷场中央，记录 15 min 内每只大鼠在中央停留的时间( s) 、总路程( cm) 。
1． 3． 2 高架十字迷宫实验( Elevated plus maze text)
待大鼠适应环境 5 min 后，将其放入“十”字状的中央并使面向闭合臂，记录 5 min 内每只大鼠进入开放臂和闭合臂的次数以及停留时间。所得结果以每只大鼠在开放臂滞留时间的百分比( %) 和进入开放臂次数的百分比( %) 表示。
1． 4 痛觉敏感度测定
分别于束缚应激前( 作为基线) 和束缚应激后1、3、7、14 d 各时间点，取空白对照组和各实验组大鼠，使用 Von Frey 纤维丝从细到粗依次对各大鼠的咬肌进行刺激; 每一型号刺激 5 次，当动物出现至少 3 次缩头、避开、抬腿、发出声音等行为时，即视为有痛觉反应，并以该 Von Frey 纤维丝对应的压力值作为该动物的痛觉阈值。痛觉阈值降低，即说明其痛觉敏感度升高。
1． 5 心理应激对 GFAP 表达影响的观察
1． 5． 1 免疫组化染色检测 GFAP 的表达水平
上述检测结束后，取各组大鼠分别在 10 g/L戊巴比妥钠过量麻醉( 50 mg/kg 腹腔注射) 下，用0． 1 mol / L 磷酸盐缓冲溶液( PBS) 经左心室快速灌注，冲净血液后换用 4 ℃ 的 40 g/L 多聚甲醛溶液 300 mL 进行灌注固定; 然后取各大鼠的脑干及颈髓，并以闩门平面为中心切取包括头向 4 mm、尾向6 mm 的组织块，放入 40 g/L 多聚甲醛液中 4 ℃下固定 4 ～6 h 后，再置于 300 g/L 蔗糖液中 4 ℃过夜。取固定后的各组织块，分别进行横向连续冰冻切片( 厚 25 μm) 。取各组切片放入 0． 1 mol/L PBS中置摇床上漂洗3 次( 每次10 min) 后，滴加驴血清封闭 10 min; 滴加鼠抗 GFAP( 1 ∶ 700) 一抗，室温、慢摇 24 h; 滴加驴抗鼠 ( 1 ∶ 500) 二抗，室温、慢摇4 h，最后再滴加 AB 液 ( 1 ∶ 500 ) ，室温、慢摇 1 h。以上每个步骤完成后均用 PBS 漂洗 3 次，每次10 min。取上述处理的所有切片，分别进行 DAB显色后，脱水、透明，中性树胶封片; 显微镜下观察并用计算机辅助成像分析装置检测各组相同部位星形胶质细胞的免疫阳性率( percent area occupiedby immuno—products( % ) )。
1． 5． 2 Western－blot 检测 GFAP 蛋白的表达水平
断头处死各组大鼠，分别取其三叉神经脊束核尾侧亚核，冰上孵育 10 min 后转移至 1． 5 mL 的离心管中，超声粉碎( 500 W) 5 s × 5 次; 10 000 r/min离心5 min，取上清并用 BCA 蛋白定量法测定总蛋白浓度。制备 12% 的分离胶和 4% 浓缩胶，然后取总蛋白以每孔20 μg 上样进行 SDS． PAGE 电泳( 浓缩胶80 V，分离胶 120V) 。电泳结束后，取适当大小的凝胶和 PVDF 膜在50 V 电压下转膜，并用丽春红染色观察转膜效果; 然后将 PVDF 膜置于50 g/L去脂奶粉中封闭2 h; 依次加入一抗 ( 1∶1000) 、二抗( 1∶1 000) 杂交，室温下振荡封闭; 化学发光显色，并用 Quantity One 4．4 软件对图像进行分析。以目的条带与内参 β－actin 条带的灰度值之比作为该样本中 GFAP 蛋白的相对表达量。
1． 6 统计学分析
采用 SPSS 13． 0 统计软件对数据( x珋 ± s) 进行one－way ANOVA 分析，两两比较用 SNK－q 检验; 疼痛阈值与 GFAP 活化水平的相关性采用 Pearson 相关分析，检验水准 α =0． 05。
2 结果
2． 1 行为学分析结果
2． 1． 1 旷场实验
随着心理应激时间的延长，大鼠旷场实验中的两指标均呈下降趋势。其中应激 7、14 d 组大鼠的中央停留时间与空白对照组相比均显著降低( P ＜0． 05) ( 图 1) ; 而应激 14 d 组大鼠的活动总路程与空白对照组相比明显降低( P ＜0． 05) ( 图 2) 。
2． 1． 2 高架十字迷宫实验
随着心理应激时间的延长，大鼠高架十字迷宫实验中的两指标均呈下降趋势。其中，应激 14 d组大鼠的开臂滞留时间百分比与空白对照组相比显著降低( P ＜0． 05) ( 图 3) ; 应激 7 d 组、14 d 组大鼠进入开臂次数百分比与空白对照组相比均显著
降低( P ＜0． 05) ( 图 4) 。
2． 2 机械性痛阈测定结果
Von Frey 纤维丝痛阈测定结果显示，随着应激时间的延长，大鼠咬肌疼痛阈值呈降低趋势。其中应激 7、14 d 组大鼠的咬肌痛觉阈值与空白对照组相比均显著降低( P ＜0． 05) ( 图 5) 。
2． 3 心理应激对 GFAP 表达的影响
2． 3． 1 免疫组化观察结果
免疫组化染色结果显示，空白对照组仅可见少量而散在分布的 GFAP 阳性细胞; 而应激不同时间后，GFAP 阳性细胞数均有所上升( 图 6) ，且随着应激时间的延长上升越来越明显; 其中应激 7 d 组和应激 14 d 组与空白对照组相比，差异均有统计学意义( P ＜0． 05) ( 图 7) 。
2． 3． 2 Western－blot 检测结果Western－blot 结果显示，心理应激后 GFAP 蛋
白的表达量在应激 7 d 和 14 d 组中有所升高，分别与空白对照组相比均有统计学差异( P ＜ 0． 05)。图 8
2． 4 疼痛阈值与 GFAP 活化水平的相关性分析
Pearson 相关分析结果显示，大鼠咬肌的疼痛阈值与 Vc 内 GFAP 免疫组化染色阳性率以及GFAP western － blot 相 对 灰 度 值 均 呈 负 相 关( P ＜0． 05) ( 表 1) 。
3 讨论
束缚应激是一种能引起典型非特异应激表现的方法，该方法不仅可通过限制动物的活动自由而使之产生应激，同时还能将应激过程对躯体的创伤性减小到最低。因此，为避免创伤性应激，本实验采用束缚应激的方法建立心理应激动物模型。行为学测试显示，大鼠受到束缚应激之后，在旷场中央区的停留时间、总路程以及进入高架十字开臂的次数和停留时间等均随应激时间的延长而呈下降趋势，表明大鼠出现了显著的焦虑抑郁样负性情绪; 并提示模型建立成功。
心理应激是机体在某种环境刺激作用下，由于客观要求和应对能力不平衡所产生的一种紧张性反应。当今社会，面对日趋复杂和激烈的社会竞争，人们往往容易产生心理应激，而心理应激又与颌面部疼痛，尤其是口颌肌的疼痛有较大相关性。Diniz 等对 55 所中学即将高考的学生进行调查发现，约有 50． 9%的人出现颞颌关节弹响、颌面部疼痛等与颞颌关节功能紊乱病相关的症状。另有研究发现，心理应激还可引起口颌肌肌电活动增加、肌紧张度升高、肌疼痛敏感度增强等。本实验应用慢性束缚的方法成功建立了大鼠心理应激模型，并观察到，应激 7 d 和 14 d 组大鼠咬肌机械性痛阈值明显下降( 疼痛敏感度明显升高) ，与本课题组前期的研究结果一致。
三叉神经脊束核 ( spinal trigeminal nucleus，STN，包括口侧亚核 Vo、极间亚核 Vi、尾侧亚核Vc) 是颌面部信息向中枢传导的第一门户，是参与口颌面部伤害性信息传递的重要部位。Sara等研究发现，心理应激可使大鼠 Vc 内的磷酸化环磷酯腺苷( cAMP) 反应成分结合蛋白( pCＲEB) 及其下游基因转录上调，故 Vc 被认为是心理应激引起疼痛的中枢关键部位。有研究证明，舌下注射福尔马林引起炎性舌头痛后，在 Vc 内可观察到星形胶质细胞活化。Kohei 等研究发现，大鼠咬肌注射完全弗氏佐剂( CFA) 后，Vc 中星形胶质细胞活化的特异性标志物 GFAP 表达量增加。除上述炎性痛外，近年来还有研究证实，通过结扎大鼠 L5 脊神经使之产生神经病理性痛时，其脊髓背角星形胶质细胞也出现明显活化。上述结果提示，无论在炎性痛还是神经病理性痛情况下，星形胶质细胞都会出现明显的活化，且与痛觉敏感度密切相关。本实验也观察到，大鼠经慢性束缚应激后，其 Vc 内的星形胶质细胞明显活化，且呈现出慢性化过程并与咬肌的痛觉敏感度相关联。
星形胶质细胞活化参与疼痛的维持可能与星形胶质细胞 － 神经元交互作用( crosstalk) 有关。有研究报道，星形胶质细胞活化后可释放各种炎性细胞因子，如白细胞介素 1( IL －1) 、白细胞介素 6( IL －6) 、肿瘤坏死因子( TNF － α) 等，从而导致神经炎症反应，并进而使之恶化和维持疼痛。汪伟等研究发现，当出现神经病理性痛时，脊髓背角 GFAP 与 c－jun N 末端激酶( pJNK) 大量共存，小胶质细胞活化标志物 CD11b 与 pp38 大量共存，且各自的表达均具有时空特异性，即小胶质细胞在神经损伤后数小时达到峰值，此后逐渐降低; 而星形胶质细胞则在神经损伤后数日至数周才逐渐活化并持续表达，提示小胶质细胞在疼痛的发生中起重要作用，星形胶质细胞在疼痛的维持和恶化阶段扮演重要角色。本实验中发现，大鼠 Vc 内GFAP 的表达在建模 7 d 后明显升高，且至少持续至 2 周，与上述结果相类似; 进一步说明星形胶质细胞可能参与介导了大鼠咬肌痛敏的持续存在。
本课题组前期的研究主要集中于心理应激后的外周水平，并观察到大鼠经心理应激后其下丘脑 － 垂体 － 肾上腺皮质轴兴奋性增强; 三叉神经节内降钙素基因相关肽( CGＲP) mＲNA 的表达水平增加。以上结果提示，来自初级传入的肽能纤维可能在 Vc 内释放增加并进而激活中枢，即外周敏化引起中枢敏化; 而在此过程中位于 Vc 的星形胶质细胞可能发挥着重要的作用。
本结果提示，Vc 可能是调控心理应激导致口颌面部疼痛的主要区域，而且 Vc 内 GFAP 的活化可能参与了心理应激后痛觉过敏的发生; 但星形胶质细胞的激活或抑制是否能直接影响心理应激后痛觉敏感的发生仍需要进一步的研究。
信息来源：上海欣软信息科技有限公司
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