大鼠、小鼠骨髓细胞检查方法

动物的胸骨、肋骨、脊椎骨等扁平骨以及四肢长骨的两端是造血的主要场所。骨髓情况可以反映全身造血功能状态。因此，采用骨髓穿刺方法以检查和观察骨髓细胞数量和质量的变化，对于动物实验后疾病的诊断、治疗效果和愈后的观察以及理论研究均有很大价值。

一、骨髓采集和处理方法

1．股骨髓

(1)大鼠：

①将大鼠常规麻醉(乙醚或戊巴比妥钠)。

②将大鼠固定于动物解剖台(大鼠用)。

③左手用血管钳钳住大鼠取骨髓侧的跖部，用右手剪开大鼠内前侧皮肤，用止血钳钝头分离肌肉，暴露股骨。

④用血管锥轻轻扭住股骨近股端，用钢锯据条(中齿或细齿)在血管钳旁边膝侧轻轻锯断股骨，锯断后，使断端朝上。

⑤用5ml或10ml注射器抽吸5～10ml空气后，将针头刺入股骨腔，另一个用载玻片放在针头一旁，迅速将空气注入股骨腔，骨髓腔内骨髓随气流冲击从股骨腔内溅于载玻片上。

⑥将溅于载玻片的骨髓液迅速推成厚薄均匀的涂片，干燥，用甲醇固定，染色。

(2)小鼠：颈推脱臼杀死小鼠，剥离出股骨，用1ml注射器(连有6号针头)吸取一定体积的Hank’s液，冲出股骨中的全部骨髓细胞，最后，让细胞悬液通过带4号针头的注射器，使细胞在悬液中充分分散。计算骨髓细胞悬液中的有核细胞数。

2．胸骨髓

在取大小鼠的胸骨髓时，先用颈椎脱臼处死，迅速剖取胸骨，剥除附于胸骨的肌肉，剪取第三节胸骨，挤出少许骨髓，用同种鼠血清做1：1稀释后涂片，晾干后用姬姆萨液染色后镜检。同样方法同时剪取第二节胸骨，挤出骨髓液，用白细胞液稀释，细胞吸管，红细胞计数法，计算骨髓有核细胞总数。

二、大鼠、小鼠骨髓检查方法和特点

1．骨髓有核细胞的计数法

其方法与白细胞计数方法相同(如有核细胞数在3×10⁴／mm³以上，则将骨髓液稀释20倍，按红细胞计数法计数之)。骨髓液中有核细胞的多少代表骨髓增生的程度，现在认为用有核细胞直接计数比以涂片来判断骨髓增生程度更为准确可靠。

2．骨髓涂片的检查法

(1)低倍镜下检查应注意下列事项：

①取材、涂片及染色情况：取材必须是真正的骨髓液，不应有明显的血液稀释；涂片要求每一个红细胞均分开排列，不太分散，亦不互相重叠；染色要红、蓝分明，颗粒清楚；没有渣滓，过浅可重染，过深则应用水、甲醇或酒精脱色后观察或再染。

若取材不好，涂片过厚或染色不良，则分类计数结果不可靠，故必须选择取材、涂片及染色满意的标本进行检验。

②计算有核细胞百分比：可以确定骨髓的增生程度(表2-1)。

③计数巨核细胞的多少：因巨核细胞体积大，常分布在涂片的边缘或尾端，每张涂片平均可找到10～30个，记录时可分为“易找到、不易找到、增多”三级。

④注意寻找有无巨大的特殊细胞，常可作为诊断的可靠依据。

(2)油镜下检查，做200～500个有核细胞分类计数。

(3)正常骨髓细胞大致有以下特点：

表2-1  有核细胞百分比评定标准

①正常骨髓中粒细胞系约占1／2，幼红细胞约占1／4，网状淋巴细胞(包括林巴细胞、单核细胞、网状细胞和浆细胞)约占1／4。

②各种细胞都是越幼稚数值越低，随着细胞的成熟数值逐渐增强，但例外的是中性杆状核粒细胞多于分叶核。

③正常骨髓一般的分类计数主要是中幼以后的中性粒细胞，中晚幼红细胞和淋巴细胞，难以见到淋巴、单核和浆细胞系的幼稚细胞和其他细胞。

在正常状况下，粒细胞为有核细胞的2～6倍，即粒：红=(2～6)：1 [即G：E=(2～6)：1，或M：E=(2～6)：1]

④血细胞在成熟的过程中，其形态变化是呈现下述的一般规律性(瑞氏染色)。

胞体：由大变小，但巨核细胞是由小变大，此外粒细胞中早幼粒细胞，前一阶段增大，以后再变小。

胞浆：量由少变多，颜色由深变浅，由深蓝变浅蓝或淡红，粒细胞的特异颗粒由无变有，由少变多，嗜中性颗粒由粗变细，染色深紫蓝色变为浅紫红色。

胞核：体积由大变小；红细胞的核最后完全消失。粒细胞系统核的形状由圆形变为分叶，核膜由不显著变为显著，染色质由细致变为粗糙，排列由疏松变为紧密，染色由浅而红变为深而蓝，核仁有到无。

成熟过程中的变化是逐渐的，而不是突然的，因此各阶段的划分是人为的。在整张涂片上往往可以看见各细胞之间的“过渡型”，当一些细胞的形态与典型的描述不符时，应考虑将其归入最邻近的较成熟的阶段，如某细胞，核似平幼粒细胞，浆似中幼粒细胞。则将其划入中幼粒细胞。

⑤中性粒细胞的毒性变化：在病理情况下，中性粒细胞可发生病理变化，如细胞大小变化颇大，时常增大；细胞外观模糊，边缘不清晰，有时可呈伪足：核染色极深而浓缩，无结构可见(核固缩)；或是核肿胀，边缘呈锯齿形，杂色质模糊疏松(核溶解)：胞浆的变化有下列数种。

中毒颗粒：嗜中性颗粒粗大，大小不等，分布不匀，染色较深，呈深紫或紫蓝色。有时颗粒很粗大，使核细胞很像嗜碱粒细胞；有时又小而稀少，混杂于嗜中性颗粒内。中毒颗粒的形成是由于在毒性(或传染性)因子作用下，胞浆中蛋白质发生凝固后。聚集在中性颗粒周围的结果。在涂片染色偏碱或染色过久时，有时可将中性颗粒误认为中毒颗粒，此时应注意比较全涂片其他细胞加以区别，且中毒颗粒常与核左移和其他毒性变化同时存在。当它和嗜碱粒细胞比较时，应注意到：嗜碱粒细胞内的核较不清晰，分叶较少，染色质较淡，颗粒较大，大小差异大，着色更深，核上也有，在边缘排列趋向更密。

空泡：可为单个，但常为多数性，大小不等，有时也可在核中出现，这是细胞脂肪性变的结果。

杜勒小体：为类似包涵体的局部嗜碱性区域，呈圆形、椭圆形、梨形或云雾状的天蓝色或灰蓝色小体，直径1～2μm，是胞浆不成熟，即核与浆发育不平衡的结果。

上述变化统称为中性粒细胞的毒性变化。通常见于严重的传染病，各种化脓性感染，大面积的烧伤以及外源性及内源性的中毒等。可单独出现一种变化，也可多种变化同时存在。