Lamin A（LMNA）相关的脂肪营养不良可能是遗传性的（与LMNA突变相关）或获得性的（与使用人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂[PIs]相关），并且在两种情况下它们都具有临床特征，例如身体的异常分布脂肪或全身性脂肪组织缺失，代谢改变和早期心血管并发症。两种LMNA相关的脂营养不良症的特征在于核纤层蛋白A前体prelamin A的积累。前蛋白A积累诱导脂肪营养不良相关表型的病理机制仍不清楚。由于这些疾病中受影响的组织来自间充质，我们已经产生了LMNA使用PI处理的人间充质干细胞的相关实验模型，其概括了在患者活组织检查中观察到的表型。该模型已被证明是解开LMNA病理机制的有用工具相关的脂肪营养不良，提供了一个理想的系统来识别潜在的目标，以产生药物发现筛查的新疗法。我们首次报道，脂肪生成受损是累积的prelamin A和Sp1转录因子之间相互作用的结果，其螯合导致细胞外基质表达改变。事实上，我们的研究显示了Sp1在人间充质干细胞中脂肪谱系分化中的新颖，必要和精细调节的作用。这些研究结果定义一个新的生理实验模型阐明病理机制LMNA -连接的脂肪营养障碍，从而为研究和治疗的新机遇不仅LMNA相关的脂肪营养不良，但也与其他脂肪生成相关的代谢疾病有关。
在核纤层蛋白A / C基因（改变LMNA）负责超过10种不同疾病称为laminopathies，包括心肌病，肌肉萎缩症，早老症，脂肪代谢障碍和[ 1，2 ]。脂肪营养障碍的特征为身体脂肪或脂肪组织和不同程度的对胰岛素作用的抵抗的一般化损失的异常分布人类疾病的一组异质，连同高甘油三酯血症[ 3，4 ]。几种类型的脂肪营养障碍的已表征在分子遗传水平，如在突变LMNA基因[ 5，6]。获得了其他脂肪营养不良症，例如与使用人免疫缺陷病毒（HIV）蛋白酶抑制剂（PI）相关的脂肪营养不良综合征，其导致未成熟的，未加工形式的核纤层蛋白A的积累，称为prelamin A [ 7 ]。
核纤层，主要位于细胞核膜的内方面，是A-和B-型核纤层蛋白组成的中间丝小梁[ 8，9 ]。在哺乳动物体细胞中，A型核纤层蛋白由核纤层蛋白A和C代表，其起源于LMNA基因的可变剪接。核纤层蛋白A被作为前体法尼基prelamin A，其经历一系列的翻译后修饰和内切蛋白水解分裂，最终导致由ZMPSTE24酶[去除C末端尾法尼基的初始产生的10 - 13 ]。关于获取的脂肪营养障碍，蛋白酶抑制剂[与核纤层蛋白A的处理干扰7通过抑制ZMPSTE24] [ 14]。这种抑制导致法呢基 - prelamin A相对于成熟的核纤层蛋白A的显着积累。除了A型核纤层蛋白在维持核的机械稳定性中的作用之外，A型核纤层蛋白的支架越来越明显。调节DNA合成，DNA损伤应答，染色质组织，基因转录，细胞周期进程，细胞迁移和细胞分化[蛋白15，16 ]。然而，这些不同的纤颤素功能与疾病病理生理学相关的方式仍有待阐明。因此，尽管有积累prelamin A和之间的链路LMNA -连接的脂肪营养障碍[ 17 - 20]，这种病理学的机制仍有待建立。
LMNA相关的脂肪营养不良综合征主要影响来自间充质来源的组织，例如脂肪谱系，其源自中胚层来源的多能干细胞群[ 21 ]。因此，我们假设prelamin A在人间充质干细胞（hMSCs）中的积累将损害其体内平衡，从而阻止它们正确完成脂肪形成程序。鉴于脂肪细胞分化涉及一组时间调节的基因表达事件[ 22 ]，可在prelamin A积累的hMSCs中发生改变，这些细胞的脂肪谱系分化能力是改变生物学功能的最佳候选者之一[ 21]]。因此，替拉那韦（TPV）处理的hMSC不会以与对照细胞相同的方式分化（例如，就脂肪生成分化速率，脂滴形成或基因表达谱分析而言），这是prelamin A积累的结果。
我们的研究结果表明，prelamin A在hMSCs中的积累导致增殖减少，引发细胞早衰和与脂质代谢相关的基因表达谱改变。通过使用源自hMSC的脂肪细胞，我们还显示PI诱导的prelamin A积累通过改变参与细胞外基质和细胞粘附的基因的正常表达来降低hMSC的分化能力。引人注目的是，最近的研究已经指出，Sp1的转录因子，除了在维持基本转录的其已知函数[ 23 ]，起着与脂肪酸合成[基因的转录中起重要作用24，25 ]和细胞外基质[ 26]，这对于脂肪组织的稳态和维持是必不可少的[ 27 ]。我们在这里证明了累积的prelamin A和Sp1之间的新的物理相互作用，作为导致PI处理的hMSC的受损脂肪生成程序的促成因素。重要的是，我们的结果首次表明Sp1转录因子活性对于正常脂肪生成中脂质囊泡的完整性是必不可少的。
人骨髓来源（BM）-MSCs和脂肪组织来源（AT）-MSCs分别来自尸体脑死亡供体（hMSCs）的利他捐赠或来自西班牙语Inbiobank节点进行化妆品吸脂术的患者国家干细胞库（FundaciónInbiomed）（http://www.inbiobank.org）。将细胞培养在低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（Sigma，St.Louis，http：//www.sigmaaldrich.com）中，补充有10％胎牛血清（FBS; Sigma），青霉素和GlutaMAX（Gibco，Grand）纽约岛，http：//www.invitrogen.com）。捐赠者的年龄和性别在补充在线表1中给出。
通过用指定浓度的HIV PI TPV处理细胞诱导Prelamin A积累。将对照细胞与媒介物二甲基亚砜（DMSO）一起温育。TPV由Hospital Universitario Cruces（西班牙巴拉卡多）的药房服务提供。对于脂肪形成分化，在汇合时接种hMSC，第二天通过在脂肪形成因子存在下培养7（早期脂肪生成）或21天（晚期脂肪生成）诱导分化：1μM地塞米松，500μM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和200μM吲哚美辛（Sigma）。
进行hMSC衍生的脂肪细胞的油红O（Sigma）染色以按照标准方案对脂滴进行染色并进行一些修改[ 28 ]。使用数码相机（Nikon E8400）在立体镜（SMZ1000; Nikon，Tokyo，http： //www.nikon.com）下拍摄照片。
在WP631（甲磺酸盐，Sp1转录因子活性的特异性抑制剂; Sigma）的情况下，诱导hMSC分化为脂肪谱系，诱导后10或19天，将WP631以不同浓度加入培养基中24小时，接着是另外24小时没有治疗。然后（第12或21天），用如下所述的BODIPY染色进行免疫荧光共聚焦显微镜检查。
在用TPV或DMSO处理下接种并培养hMSC。培养5天后，将细胞分离，计数，并以初始浓度重新接种。重复该过程直至第11代。如先前报道的那样计算群体倍增水平（PDL）[ 20 ]。
将80微克总细胞提取物加载到4％-12％NuPAGE Novex 2- [双（2-羟乙基）氨基] -2-（羟甲基）丙烷-1,3-二醇微型凝胶（Invitrogen，Carlsbad，CA，http）中。 ：//www.invitrogen.com），在200V下进行电泳4小时，以实现prelamin A和lamin A条带之间的分离。使用一抗（sc-6215; Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，http：//www.scbt.com）以1：100稀释和适当的方式进行prelamin A和lamin A / C的Western印迹。与辣根过氧化物酶偶联的二抗（1：5,000稀释）。使用SuperSignal West Pico化学发光底物开发试剂盒（Thermo Scientific Pierce，Rockford，IL，http：//www.piercenet.com）来开发信号。
对于免疫荧光实验，将在玻璃盖玻片上生长的hMSC在4％多聚甲醛（Sigma）中在室温下固定15分钟。将样品与含有5％FBS的磷酸盐缓冲盐水一起温育以使非特异性结合饱和，并在室温下用0.1％Triton X-100（Sigma）透化1小时。一抗和二抗的稀释液（Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA，http：//www.jacksonimmuno.com）在类似的溶液中制备，并在室温下各孵育1小时。用抗褪色试剂（Invitrogen）固定载玻片。BODIPY 493/503（Invitrogen）按照制造商的说明用于染色脂滴。原位邻近连接测定（PLA）技术与抗prelamin A（sc-6214; Santa Cruz Biotechnology）和抗-Sp1（sc-14027; Santa Cruz Biotechnology）一起用作抗体并使用抗山羊PLUS和根据制造商的协议，抗兔MINUS Duolink原位PLA试剂盒（Olink Bioscience，Uppsala，Sweden，http： //www.olink.com ）。
将细胞接种在室玻片（Lab-Tek; Nunc，Rochester，NY，http：//www.nuncbrand.com ）中，并如[ 29 ] 所述进行处理。使用数码相机（Morada Soft Imaging System; Olympus，Tokyo，http：// www。）在透射电子显微镜（Tecnai Spirit G2; FEI，Eindhoven，The Netherlands，http：//www.com）下获得显微照片。 olympus-global.com）。使用每种处理的至少100个细胞的三次独立测量来计算异染色质聚集体的平均长度。
使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Cell Signaling Technology，Beverly，MA，http：//www.cellsignal.com）按照制造商的说明在第9代评估衰老相关的β-半乳糖苷酶活性。
在细胞培养结束时，洗涤hMSC，重悬浮于染色缓冲液中，并用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I（Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ，http：//www.bd.com）检查。通过FACSCalibur（Becton Dickinson）分析染色细胞。
从衍生自两个独立骨髓供体的两个独立hMSC细胞系进行微阵列实验。每次处理表征两个生物学重复和一个技术重复：因此，每个处理进行三次独立杂交。使用High Pure RNA分离试剂盒（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，http：//www.roche-applied-science.com）按照制造商的说明分离总RNA，并用NanoDrop 2000分光光度计（Fisher Scientific International，Hampton）定量。 ，NH，http：//www.fisherscientific.com）。使用RNA 6000 Nano Kits在Bioanalyzer中评估RNA质量（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，http：//www.agilent.com）。使用HumanHT-12 v4 Expression BeadChips（Illumina Inc.，San Diego，http： //www.illumina.com）进行全基因组基因表达表征，其允许查询覆盖超过25,000个人注释基因的47,000个基因靶标。 。用Epicenter用于Illumina系统的TargetAmp Nanog Biotin-aRNA标记试剂盒进行cRNA合成，随后根据制造商的方案进行扩增，标记和杂交。
表达数据与R / Bioconductor的统计计算环境进行分析（http://www.r-project.org，http://www.bioconductor.org）。使用“lumi”包[ 30 ]，对原始表达数据进行log2变换和分位数归一化。为了检测差异表达的基因，将线性模型拟合到微阵列，并使用来自Bioconductor 的“limma”包[ 31 ] 计算经验贝叶斯调节的T统计量。微阵列数据保藏在ArrayExpress（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress），登录号为E-MEXP-3289。
对于感兴趣的基因的自动功能注释和分类，使用注释数据库，可视化和集成发现（DAVID）基因本体论（GO）数据库（http://david.abcc.ncifcrf.gov）分析失调的基因[ 32]。考虑到包含人HT12 v4 Illumina微阵列上存在的所有基因的背景。对于该分析，认为具有倍数变化大于1.4或小于-1.4（p <.05）的基因受到调节。没有注释的探针组从分析中删除。统计学上过度代表的GO术语通过选择具有表达分析系统资源管理器（EASE）评分的那些[ 33 ]（修正的Fisher精确概率p）来确定 值）<。05。
为了测试失调基因启动子内转录因子结合位点的可能富集，使用了DiRE服务器（http://dire.dcode.org）[ 34 ]。失调的基因列表包含足够的注释基因，以准确评估存在的调节元件的数量。完整的人类微阵列基因列表用作背景。“发生”代表含有特定转录因子结合位点的推定调节元件的部分，而“重要性”定义为发生和分配给每个转录因子的重量之间的乘积。
使用Nucleofector（Lonza，Basel，Switzerland，http：//www.lonza.com）用含有视黄酸反应元件的pGL3-RARE-Luc报告质粒瞬时转染hMSC （Addgene，Cambridge，MA，http：// www。 addgene.org），NF3TK-Luc质粒含有3×核因子-κB（NF-κB）增强子，或pSp1荧光素酶报告质粒。用Renilla荧光素酶对照载体（pRL-TK; Promega，Madison，WI，http：//www.promega.com）共转染确定转染效率。使用Dual-Glo荧光素酶测定系统（Promega）在GloMax 20/20发光计（Promega）中一式两份测量荧光素酶活性，并将结果标准化为蛋白质含量并表示为高于对照水平的倍数诱导。
如所示，所有实验在至少两种不同的骨髓或脂肪组织衍生的hMSC中一式三份进行。所有数据均表示为平均值±SD。对于在两个生物学重复中进行的实验，使用n = 3个技术重复进行统计学分析。对于在三个或四个生物学重复中进行的实验，n表示生物学重复的数量。将每种处理与对照进行比较，并使用Bonferroni校正的非参数Mann-Whitney U检验确定两组之间的显着差异。p <.025的值被视为统计显着性的指示。
为了证实法尼基化的prelamin A在我们的实验模型中在TPV处理下累积（如在成纤维细胞中报道的[ 20 ]），用升高的非生理学浓度的TPV（50和100μM）处理hMSC。通过蛋白质印迹测定prelamin A的存在：而在对照细胞（载体）中几乎检测不到prelamin A，并且在用50μMTPV处理的样品中，在100μMTPV处理后观察到显着的prelamin A积累，表明TPV剂量 - prelamin A的依赖性积累（图1一个）。TPV处理的细胞中prelamin A的电泳迁移率比非法尼基化的prelamin A的电泳迁移率快，后者在用法呢基转移酶抑制剂（阳性对照泳道）处理的细胞中积累，表明这种较高的prelamin A带是法尼基化的，如同之前已经描述过人和小鼠成纤维细胞[ 14 ]。通过免疫荧光证实了用较低TPV浓度（30μM）处理的细胞中prelamin A的积累（图1B）。虽然先前已经证实具有LMNA突变或用PI处理的成纤维细胞显示核形状异常[ 20 ]，但TPV处理的hMSC的细胞核未显示出显着的改变（数据未显示）。
Prelamin在TPV处理的人间充质干细胞（hMSC）中积累和改变染色质组织。（A）： prelamin的蛋白质印迹A.法呢基转移酶抑制剂处理显示为阳性对照。Lamin C用作上样对照。（B）： Prelamin A通过免疫荧光染色。比例尺=50μm。（C，D）：显示在三种不同BM-hMSC中进行的异染色质聚集体（小箭头）和脂质双层（大箭头）的电子显微照片。异染色质的异常缩合显示在（D）的下图中。比例尺= 2nm （C）和500nm （D）。缩写：BM，骨髓; 控制; DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚; TPV，tipranavir。
异染色质蛋白1γ（HP1γ）是核层与染色质之间的衔接子之一[ 35]]。由于来自具有严重遗传性骨病的个体的成纤维细胞，例如早衰，显示HP1γ的表达降低，我们想要测试TPV治疗是否在hMSC中显示相似的核表型。如在线补充图1所示，TPV处理以浓度依赖性方式引起hMSC中HP1γ病灶的丧失（在50μMTPV时损失20％，在20μMTPV时损失12％而对照细胞中为6％）。这种改变的HP1γ表达促使我们通过透射电子显微镜分析用TPV处理的hMSC的内核膜（INM）。在对照细胞中，INM中整个脂双层的染色质布局厚度是均匀的（35.23±2.28nm宽;图1D中的大箭头），除了核孔复合物，它被中断，如图1C和图1C所示。 1D。然而，在TPV处理的细胞中，我们在INM中观察到染色质消失的区域，以及具有异染色质聚集体模式的几个区域，达到650nm的长度（图1C，1D，小箭头）。异染色质聚集体的平均长度为300.67±17.54nm（图1C）。百分之七十五的处理细胞显示出这些异常，而对照细胞则为30％。在处理细胞的核质中观察到异染色质的异常浓缩，但在仅用载体处理的细胞中未观察到（图1D）。这些结果与先前在患有椎板病的患者的成纤维细胞中进行的研究一致[ 百分之七十五的处理细胞显示出这些异常，而对照细胞则为30％。在处理细胞的核质中观察到异染色质的异常浓缩，但在仅用载体处理的细胞中未观察到（图1D）。这些结果与先前在患有椎板病的患者的成纤维细胞中进行的研究一致[ 百分之七十五的处理细胞显示出这些异常，而对照细胞则为30％。在处理细胞的核质中观察到异染色质的异常浓缩，但在仅用载体处理的细胞中未观察到（图1D）。这些结果与先前在患有椎板病的患者的成纤维细胞中进行的研究一致[36 - 39 ]。
分析了TPV处理下hMSCs的增殖能力，因为PI处理已经显示出显着降低培养中原代成纤维细胞的增殖能力[ 20 ]。使用两种TPV浓度，生理学上20μM[ 14 ]和稍高浓度的30μM。对照hMSC的PDL在第6代时开始保持稳定，当它开始减少时，尽管在第11代之前观察到一些增殖（图2）一个）。相反，用TPV处理的hMSC的增殖率显示出轻微但显着的降低，在第11代时达到停滞的细胞分裂（PDL <1.0）。这种效应在30μMTPV处理（第5和第7代之间）中更明显，尽管在第11代，TPV浓度均诱导了相似的增殖停滞。通过流式细胞术鉴定的凋亡细胞占所有条件下总细胞的不到10％，并且载体和TPV处理之间没有显着差异（图 2B ），表明TPV处理的hMSCs可能比对照细胞更早进入衰老。衰老后，细胞变得扁平化和扩大，表现出生化变化，例如衰老相关的β-半乳糖苷酶的核周活性增加[ 40]，41 ]。我们染色在通道9的hMSC用5-溴-4-氯-3-吲哚基- β- d半乳糖苷和观察到的衰老细胞的TPV处理的样品（40.89％和51.00％的比例较高与20μM的TPV和30μM TPV处理分别对比BM-hMSC中28.6％的对照;以及50.46％和52.40％对比不同骨髓来源的hMSC中的30％（图 2C ）。
由hMSC中累积的prelamin A显示的细胞表型促使我们研究这些细胞的转录谱，试图找到可以解释这些表型的分子机制。为此，我们进行了一项全基因组，基于微阵列的基因表达分析，从hMSCs中提取RNA，用TPV处理7代，此时细胞增殖减少，细胞衰老增加开始发生（图2） A，A，2C）。2 C）。用生理浓度（即20μM）的TPV处理hMSC，并用DMSO处理相应的对照细胞。显着变化（倍数变化±1.4，p<0.05）在编码80个注释基因的111个转录物（7.7％下调，92.3％上调）的表达中被鉴定（补充在线表2）。令人惊讶的是，使用DAVID生物信息学资源[ 32 ] 对受管制的转录本列表进行GO分析，发现“脂质生物合成过程”和“类固醇代谢过程”是生物过程中两个最显着丰富的类别（EASE分数分别<0.023和0.019） ）（表1），表明prelamin A在hMSCs中的积累改变了脂质体内平衡。
具有累积的prelamin A的人间充质干细胞（hMSC）显示与脂质代谢过程相关的基因的基因表达谱改变
通过GO分析鉴定生物过程类别在用20μM替拉那韦处理的hMSC的失调基因中显着富集（EASE得分<0.05）。与脂质代谢过程相关的类别以粗体标记。
缩写：EASE，表达分析系统资源管理器; GO，基因本体论。
我们想证实这通过功能测定由prelamin A的积累引起的hMSC中脂质体内平衡的改变。为了这个目的，我们研究TPV处理对参与脂质代谢，一个通路中的作用，如视黄酸途径，其调节靶基因控制脂质代谢[转录42，43 ]。PI治疗与视黄酸信号传导途径改变之间的已知关系进一步支持视黄酸途径的选择[ 44]]。用含有视黄酸反应元件（RARE）的荧光素酶报告载体在其启动子中转染hMSC，转染后，用TPV处理细胞48小时。在TPV存在下，RARE活性显着低于对照细胞（图 2D），表明prelamin A积累诱导视黄酸途径的转录活性的抑制。此外，当用TPV处理hMSC 24小时，然后在没有处理（TPV恢复）的情况下再处理24小时后，RARE活性恢复到对照细胞中所见的水平，证实在用48小时处理后观察到下调。 TPV是特定的（图2d）。作为TPV治疗的阴性对照，使用NF-κB报告载体进行类似的实验，因为微阵列数据显示NF-κB途径的主要效应子的表达没有改变。如在所示图2 d，该途径没有被TPV治疗改变。
基因表达调控结果鼓励我们研究hMSCs与累积的prelamin A的脂肪谱系分化能力。因此，hMSCs用TPV或DMSO处理7代，然后在21天内诱导分化为脂肪细胞，维持TPV或DMSO处理。最TPV处理的hMSC分化的脂肪细胞显示prelamin A的积累（图3 A，A，3C， 3 C，红核）和降低的成脂分化的能力，通过油红O染色（如检测到图3B）。用BODIPY荧光分子染色脂滴，其特异性地染色细胞内脂滴。TPV处理与积累prelamin hMSC衍生的脂肪细胞A显示在它们的脂滴大小（的显着降低图3 A，A，3C， 3 C，更高的放大倍率）。同样地，如图 3D中所观察到的，我们检测到TPV处理的hMSC衍生的脂肪细胞在晚期脂肪形成中的核异常和起泡的显着增加（TPV30μM中23.57％，DMSO中9.78％，p <.025） 。这些结果表明在这些hMSC中prelamin A积累和脂肪生成受损之间存在直接关系。
为了进一步阐明由hMSC衍生的脂肪细胞与prelamin A的积累所显示的脂肪生成减少的分子机制，进行全基因组基因表达比较。将hMSC用生理浓度为20μM的TPV或DMSO处理7代，然后在7天（早期脂肪生成）和21天（晚期脂肪生成）诱导分化为脂肪细胞，维持TPV或DMSO处理。用TPV处理的早期脂肪生成样品显示出显着变化，其中大多数是下调，在49个转录物的表达中，编码44个注释基因（倍数变化，±1.4，p<.05）与对照细胞比较（补充在线表3）。令人惊讶的是，这些受调控基因的GO分析显示“细胞外基质”和“细胞粘附调节”类别的显着过度表达（p <.001），但没有与脂质代谢相关的富集类别（补充在线表4）。对于晚期脂肪生成中TPV处理的细胞，105个转录本的表达发生了显着变化，编码87个注释基因（倍数变化±1.4，p <.05）被确定（补充在线表5），并且与早期一样脂肪生成基因调控，“细胞外基质”和“生物粘附”的类别显着丰富（p <.01）（表2））。通过对来自这些类别的基因子集的定量逆转录 - 聚合酶链反应分析验证了这些结果，证实了它们在TPV处理的hMSC和hMSC衍生的脂肪细胞中的显着改变的表达（在线补充图2）。
Prelamin A积累损害人间充质干细胞（hMSC）向脂肪细胞的分化
通过GO分析鉴定生物过程和细胞组分类别，其在用20μM替拉那韦处理的晚期脂肪形成中的hMSC衍生的脂肪细胞的失调基因中显着富集。
缩写：EASE，表达分析系统资源管理器; GO，基因本体论。
使用比较基因组工具DiRE扩展了失调基因的计算机分析，该工具预测共表达基因启动子内转录因子结合位点的富集[ 34]]。有趣的是，我们发现Sp1转录因子被预测为hMSC衍生的脂肪细胞中失调基因启动子中最重要的转录因子之一，在晚期脂肪形成中累积了prelamin A（重要性，0.2;发生率，26％）。该结果表明TPV处理的hMSC衍生的脂肪细胞中基因表达的改变可部分地由Sp1介导。有趣的是，已知Sp1参与维持3T3-L1脂肪细胞中细胞外基质基因的基础水平，并且必须调节其活性以促进脂肪生成过程的进展[ 26]。因此，这种计算机分析表明，prelamin A积累本身可能会阻止正常的Sp1转录因子活性。由于先前的一项研究报道了通过累积的prelamin A [ 17 ] 隔离了SREBP1转录因子（与脂质代谢相关），我们进行了原位PLA以探索Sp1和prelamin A之间可能的相互作用。对于这种技术，主要的距离使用（在我们的情况下，抗SP1和抗prelamin A）抗体必须小于40纳米为PLA以产生一个信号，使得该方法高度特异于物理上相互作用的蛋白-蛋白复合物[ 45 - 47 ]。如图4所示A，通过PLA测定在从hMSC分化21天的脂肪细胞中检测到Sp1和prelamin A之间的稳定相互作用。我们未能检测到这两种蛋白质在载体细胞中的任何相互作用（图4A）。
Prelamin A在晚期脂肪生成中与Sp1共定位，影响Sp1转录因子活性。（A）： prelamin A和Sp1的邻近连接测定。红点对应于蛋白质 - 蛋白质物理相互作用。比例尺=20μm。（B）： Sp1报告载体测定在骨髓来源的人间充质干细胞（hMSC）中一式三份进行，并且在不同的骨髓来源的hMSC中一式两份进行。hMSCs是核转录的; 24小时后，诱导脂肪生成72小时，然后测量萤火虫和海肾的活动。缩写：BM，骨髓; TPV，tipranavir。
为了研究Sp1转录因子和prelamin A之间的这种相互作用是否可能是Sp1转录活性改变的原因，我们用Sp1-Luc报道载体进行荧光素酶报告载体测定（图 4B）。正如预期的那样，在TPV处理的脂肪细胞中Sp1转录活性降低，可能是因为prelamin A的Sp1保留。
为了检查Sp1转录因子活性的改变是否是造成prelamin A-积累的hMSCs中脂肪生成受损的原因，我们使用了Sp1特异性抑制剂WP631，一种双重插入的蒽环类药物，可特异性抑制Sp1依赖性转录[ 26，48，49 ]。我们想要确定Sp1转录因子活性的改变是否会影响hMSCs的脂肪谱系分化过程，这取决于添加Sp1特异性抑制剂WP631时脂肪生成过程的时间点。如图5所示在hMSC衍生的脂肪细胞分化的第10天（当脂滴开始出现时），WP631处理以剂量依赖性方式降低其脂质囊泡大小。当在分化期结束时（第19天）添加WP631时，我们观察到脂质囊泡大小的减少，也呈剂量依赖性，尽管这种减少并不明显（图5））。有趣的是，我们分析了在分化过程结束时（第21天）通过油红O染色处理WP631后的脂肪生成恢复，发现在分化的第10天加入高浓度的WP631后，脂肪生成无法恢复（在线补充图3） ）。然而，当在第19天添加WP631时，该抑制剂对脂肪生成几乎没有影响（在线补充图3）。总之，这些结果表明Sp1转录因子对脂质囊泡的维持和完整性的要求，并表明Sp1活性是进行适当的脂肪形成程序的基础。
脂肪生成涉及由转录因子协调的连续和有序的基因表达事件级联，其同时诱导组织特异性基因表达并抑制交替的细胞命运[ 22 ]。这种脂肪形成过程涉及细胞外基质的显着重塑，因为当细胞从承诺期移动到生长期时，细胞外基质从纤维状进展到层状结构，其特征在于储存大量的甘油三酯[ 27 ]。LMNA相关的脂肪营养不良可能是遗传的（与LMNA相关）突变）或获得（作为HIV抗逆转录病毒治疗的结果），并且在两种情况下它们都具有临床特征，例如体脂的异常分布或脂肪组织的全身性丧失; 代谢改变，包括胰岛素抵抗和高甘油三酯血症; 和早期心血管并发症[ 50，51 ]。它们具有生物学特征，如先前研究中所见，使用在对照成纤维细胞中进行的HIV蛋白酶抑制剂治疗，以及与LMNA相关的脂肪营养不良患者细胞 - 前体蛋白A的积累，核形状异常和由于缺陷处理的缺陷导致的增殖活性降低。 A [ 14，17，20]。在prelamin A积累时造成这些脂营养不良表型的机制仍不清楚。
遗传和获得性LMNA相关的脂肪营养不良综合征主要影响间充质来源的组织; 因此，我们的实验模型基于用HIV蛋白酶抑制剂治疗的hMSCs，该蛋白酶抑制剂之前已被证明可在体外抑制小鼠ZMPSTE24并诱导小鼠prelamin A积累[ 14]]。该实验模型避免了使用鼠类细胞（例如3T3-L1前脂肪细胞）可能产生的任何种间差异，并且提供了原代培养细胞相对于已建立的细胞系的所有优点。此外，虽然文献中关于BM-和AT-hMSCs是否具有分化为脂肪细胞的相同潜力存在争议，但我们关注的是比较研究，这些研究报告了这些细胞在脂肪形成分化能力方面的相似性[ 52，53 ]。然而，一些研究报告称，肥胖动物的皮下脂肪库显示脂质代谢相关基因的显着上调[ 54]]。因此，我们进行的主要实验是使用骨髓来源的hMSC进行的，以避免某些AT-hMSC可能引发脂质代谢改变的可能性。尽管如此，我们已经证实，prelamin A的积累以与骨髓衍生的hMSC中观察到的相似的方式诱导PI处理的AT-hMSC的脂肪形成能力降低（在线补充图4）。此外，由于是的hMSC的原代细胞，其增殖和分化的能力可以通过基因型，供体的年龄，和健康状况[影响52，55]，我们已经在相同细胞传代数和来自至少两个独立骨髓供体的hMSC中进行了所有实验，并在三个独立实验中进行了所有实验，以解释这一挑战并验证我们的结果。
如已经在脂肪代谢障碍联laminopathies [具体描述只是观察prelamin A的积累在所述的hMSC治疗PI的结果17 - 20 ]。此外，我们提出的模型概括了先前在PI治疗的成纤维细胞中观察到的特征，以及与LMNA相关的脂肪营养不良相关患者成纤维细胞[ 20]]。经处理的hMSC显示出增殖能力的浓度依赖性降低和细胞衰老的增加，而细胞凋亡水平没有任何改变。此外，利用积累prelamin甲的hMSC显示出与与来自家族部分脂肪营养障碍患者的成纤维细胞的前一份报告（协议周异染色质改变分配核的显著百分比LMNA -连接的脂肪代谢障碍）[ 26，56 ]，以及在表征其他laminopathies由脂肪营养不良的表型，即加速老化病症哈钦森-吉尔福德早衰综合征（HPGS）[ 38，57，58 ]和mandibuloacral发育不良类型A [ 37，39 ]。这些结果验证PI处理的hMSC作为LMNA连接的脂肪营养不良的实验模型。
对未分化的hMSC TPV处理的细胞进行的基因表达模式研究显示参与脂质体内平衡的基因发生改变，这一发现通过视黄酸信号传导途径报告基因的下调得到证实。LMNA相关的脂肪代谢障碍患者（2型家族性部分脂肪营养不良）的大腿和腹部活组织检查不仅显示了prelamin A的积累，而且还显示了参与脂肪生成的几种基因的表达降低[ 56 ]。此外，在经过PI处理的鼠3T3细胞中已经描述了参与脂质代谢的基因的异常表达模式[ 59 ]。这些报告强调了我们的结果，并表明当prelamin A积累时对hMSC脂肪谱系分化的潜在影响。
正如预期的那样，prelamin A积累的hMSC的脂肪谱系分化能力被改变。这些结果与LMNA相关疾病早衰（HPGS）一致，其中表达突变的prelamin A的hMSC称为progerin，显示出脂肪生成潜力降低[ 60 ]。这种致命疾病由突变prelamin甲早衰蛋白的积累引起的，似乎影响主要间充质谱系[ 2，18，61 ]。详细地，我们的实验模型表明prelamin A积累影响脂质囊泡的完整性，因为我们在分化的TPV处理的hMSC中检测到比对照hMSC更少的分化细胞和更小的脂质囊泡。
在分化的prelamin A积累的hMSC中改变的基因表达模式指向细胞外基质基因。值得注意的是，细胞外基质在脂肪细胞发育和功能中发挥着至关重要的作用，并且暗示在脂质代谢中[ 27 ]。此外，之前的一项研究表明HIV-PI可能通过改变细胞外基质成分来抑制脂肪形成分化[ 62 ]。此外，已发现这类细胞外基质基因在早衰研究中有所改变，包括培养的HGPS细胞[ 63 ]，表达progerin的hMSCs [ 60 ]，早老鼠模型[ 64 ]和早老素诱导的多能干细胞衍生的hMSC。模型[ 65]。这些研究的两个占由两个不同的信号通路，所述Wnt和Notch途径[观察到的改变的表达模式60，64 ]。然而，在我们的实验模型中，Notch信号传导途径的下游效应子和Wnt信号传导基因都没有表现出改变的表达。
我们在硅片上的研究指出，无处不在的转录因子Sp1，这已被证明在调节细胞外基质[发挥作用26，66，67 ]和脂质代谢[ 24，25 ]的基因，是几个的一个电位器本文获得的失调基因。实际上，一些脂质代谢相关基因，如SCD [ 68 ]，SULT1A1 [ 69 ]和ABCA1 [ 70]]，是Sp1的已知目标。此外，我们用Toucan程序进行的计算机分析显示，在微阵列数据分析中发现许多失调的细胞外基质基因（CTHRC1，LAMA3，PODNL1，LAMC2和TIMP2））在其启动子中显示Sp1结合位点。总之，这些结果直接暗示Sp1在细胞外基质和脂质代谢基因表达的失调中，这对于进行脂肪生成程序是必需的。我们首次描述了累积的prelamin A和转录因子Sp1之间的新型相互作用，具有功能性后果，正如prelamin A-积累的hMSC中Sp1活性的降低所证明的那样。我们发现Sp1特异性抑制剂再现了在prelamin A积累的hMSC中进行的脂肪生成程序中观察到的表型，其中分化减少并且脂肪细胞以TPV剂量依赖性方式显示较小的脂质囊泡。该结果清楚地证明了prelamin A和Sp1之间相互作用的生理相关性。LMNA相关的脂肪营养不良包括累积的prelamin A和转录因子的相互作用，通过改变细胞外基质在脂肪生成过程中起重要作用。在这种机制中，转录因子与累积的核纤层蛋白A前体的相互作用可以限制转录因子对其靶基因的接近，从而损害它们的功能。除了此处描述的结果之外，该理论还得到先前报道的累积prelamin A和SREBP1之间相互作用的支持，SREBP1是一种转录因子，在控制参与脂肪细胞分化的基因中发挥重要作用[ 17]]。关于这个问题，已知SREBP1的转录因子是对自己弱转录活化因子和它与另外监管部门在其靶启动与蛋白质如NF-Y和Sp1的[合作互动71 - 73 ]。此外，人类HepG2细胞的全基因组占据分析揭示了一组脂质代谢相关基因中SREBP1，NFY和Sp1的启动子占据[ 74]]，表明这些因素的组合调节了这种功能途径。考虑到这些发现，前体蛋白A在脂肪形成中的Sp1螯合可能部分地导致SREBP1功能的改变。然而，我们没有观察到从微阵列数据获得的失调基因中SREBP1靶基因的任何富集。这可能表明hMSC中prelamin A的Sp1螯合不足以诱导SREBP1靶基因转录的改变。
最后，我们已经描述了Sp1在hMSC脂肪谱系分化期间的新作用，并且鉴于在脂肪谱系分化期间添加Sp1抑制剂的时间对于脂肪生成的损害是至关重要的，因此该Sp1功能似乎被精细调整。相同浓度的Sp1特异性抑制剂在不同时间点产生一些轻度和一些严重表型，表明在hMSC脂肪形成过程中Sp1的精确和时间敏感性调节。事实上，可以想象Sp1通过调节细胞外基质组成在早期形成脂滴中起关键作用。值得注意的是，在来自积聚prelamin A的hMSCs的脂肪细胞中，我们没有观察到波形蛋白或脂肪细胞分化相关蛋白的mRNA水平的任何失调，75，76 ]和由Sp1的[调节 77，78 ]。这可能是由于Sp1与这些基因转录中的其他转录因子之间的功能冗余。我们的研究结果表明，Sp1在细胞外基质基因的转录控制中具有特定的作用，这会影响脂肪生成程序的正确执行。事实上，脂肪生成的两个阶段，脂肪细胞对甘油三酯储存的贡献以及高水平甘油三酯的积累，与细胞外基质成分的双相产生有关，这与细胞外基质在脂肪生成过程中的不断更新一致[ 27 ]。
PI（TPV）处理的hMSC为LMNA-连接的脂肪营养不良提供生理实验模型，重现在患者活组织检查中观察到的不同表型。该模型已被证明是揭示LMNA机制的重要工具相关的脂肪营养不良。此外，该模型提供了理想的系统，以识别潜在的目标，以产生新的疗法，并进行药物发现筛查。本研究首次报道了由于Sp1转录因子与累积的prelamin A相互作用导致脂肪生成受损的机制。事实上，我们的研究表明Sp1在脂肪谱系中具有新的，必需的和精细调节的作用。人间充质干细胞的分化。总之，这些发现使一个新的生理实验模型阐明的病理机制LMNA -连接的脂肪营养障碍，另外，为研究和治疗，不仅新的机遇LMNA相关的脂肪营养不良，但也与其他脂肪生成相关的代谢疾病有关。
我们非常感谢MAIñiguez博士（西班牙马德里CentrodeBiologíaMolecular“Severo Ochoa”）和Frank Peiretti博士（法国马赛大学德拉尼大学）为我们提供pNF3TK-Luc和pRL-TK报告人载体和pSp1-Luc报告载体分别。我们感谢Catherine Shanahan博士（伦敦国王学院）对prelamin A抗体的帮助。我们感谢里卡多·安德拉德博士获得巴斯克地区普通研究服务大学（SGIKER）共聚焦显微镜服务的帮助和专业知识。特别感谢Leslie Mounkes博士对手稿的重要修订。这项工作得到了欧盟的资助; 玛丽居里国际重返社会拨款MIRG-CT-2006-044914; FondodeInvestigaciónSanitaria（Instituto de Salud Carlos III，Madrid，Spain）Grant PI06-1335; 巴斯克自治区政府工业，旅游和贸易部（Etortek研究计划2009/2011）; 和Bizkaia县创新技术部。GRdE是来自巴斯克教育，大学和研究部的FPI Grant BFI09-135支持的博士后研究员。
GRdE和AI：实验设计，装配，分析，写作; KS：数据的汇编，分析和解释; AMA和JMG-V：数据分析和解释; AF和MS：实验装配; AGM：实验装配，分析和写作; CIR：数据的概念和设计，汇编，分析和解释，稿件撰写，稿件的最终批准。
联系客服
