续上文：NEJM和BioRxiv文章教你怎么用mNGS诊断脑炎及脑膜炎（一）
4、送一份合格脑脊液mNGS样本的5点注意？
a. 留取2-3ml脑脊液至无菌干燥冻存管中；-18℃度或以下冰箱保存；
b. 严格的无菌操作
c. 避免溶血污染的脑脊液；
d. 如出现脑脊液细胞学>200/mm3时，高宿主背景有可能会降低mNGS的敏感度；
e. 根据重点专项课题的经验，最好是第三管之后的脑脊液（即中段脑脊液）
5、
当获得阳性报告，临床医生该怎么处理？
a. 结合临床进行报告解读
针对一份mNGS报告需综合比对临床症状、病史及传统实验室检查结果。
若mNGS阳性且符合临床（很重要！），阳性报告可增强医生的用药信心，进一步根据mNGS信息指导治疗；
若mNGS的结果不符合该病原体的典型临床症状，排除感染以外的脑炎可能，临床仍考虑感染性脑（膜）炎，可考虑结合临床，根据mNGS信息给予可覆盖的药物进行诊断性治疗；
若mNGS提示多种微生物阳性怎么处理？最常见的合并感染是EB病毒，如有效reads相对较低（<10），不排除EBV处于潜伏状态，应根据血清学指标判断复燃可能性，再进一步考虑是否开始抗病毒治疗。其他微生物需结合临床进行讨论，可联系检测单位进行报告解读。
b. 阳性指标怎么来的？
目前国内外并没有统一的标准。
Chiu教授2019年5月在Genome research发文实验室验证mNGS检测技术临床标本检测灵敏度73%，特异度99%，并且在文中提出了用于NEJM文章的阳性判断指标：对于细菌，真菌，寄生虫 RPM-r（RPM：reads per million；）≥10为阳性；对于病毒，同时存在≥3个基因组区域的reads为阳性。
关教授在文中提出另一套阳性指标：对于胞外菌、真菌（除隐球菌）、寄生虫SSRN（种间特异性序列数）≥30，RPM（序列数＞1.5）；对于胞内菌（除结核及布氏外）和隐球菌，SSRN≥10（RPM>0.5）为阳性；对于病毒，布氏及结核分枝杆菌SSRN≥3（RPM>0.015）为阳性。目前我国采用华大技术体系的公司主要依照SSRN方案。
予果微码公司采用标准依照自主研发的“置信度”方案。置信度方案综合考虑RPM-r和其他基因组及临床维度通过机器学习建立分类器（以基因组维度为例，测序结果中同时存在≥3个基因组区域的reads支持置信度高的判读）。
6、当遇到阴性报告，临床医生该如何进一步处置？
阴性报告：可分为真阴性及假阴性；目前真阴性及假阴性并无明确统一的规定。根据目前的结果，真阴性：低于阳性指标，本次实验指控正常，无可疑有效reads较低的致病菌（结核、隐球菌）；建议医生可进一步考虑RNA感染、免疫性炎症、肿瘤性炎症或感染后期等，需结合临床进行多维度综合分析。C.Y.Chiu教授文中提到[2]：在疑难脑（膜）炎及脊髓炎的mNGS诊断中，仍有49.5%原因不明；疑难脑（膜）炎及脊髓炎中最终明确的病因包括：27.9%感染，8.3%免疫，3.4%的脑肿瘤，1.5%感染后期，1.5%代谢中毒，0.5%血管因素，7.4%其他原因。从另一个角度理解这个数据，说明人类对中枢神经系统炎症还有很多未知的领域需要进一步探索。
什么原因导致假阴性结果：C.Y.Chiu教授在《Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid》文章中认真分析21例假阴性结果。总结假阴性原因可能是：
低于报告设定阳性阈值的结果（结核、隐球菌等难测微生物）；
高宿主背景淹没病原体信息；
经过抗生素治疗以及CSF样本的反复冻融导致病原核酸减少；
传统方案假阳性或弱阳性（如细菌培养污染，PPD弱阳性）与mNGS结果南辕北辙。[1]
关于结核的检出率的不确定性，中美专家意见一致，因此结核的假阴性结果不可小视。当出现临床考虑结核但mNGS出现阴性的情况，需要进一步从检测前是否使用过抗结核治疗、临床症状、抗原抗体检测结果等方向综合考虑，以及验证性治疗等角度进行进一步评估。此外还要关注类似结核感染症状的其他病原体出现并低于阳性阈值的可能，包括但不限于非结核分枝杆菌、布鲁氏菌等。重点专项研究曾发现7例（拟）诊断为结核性脑膜（脑）炎患者，最终通过mNGS及抗体确诊为寄生虫感染（二代测序诊断七例不典型脑囊虫病费笑非等，中华医学会第二十一次全国神经病学学术会议，2018）。
7、mNGS技术的未来临床应用和对临床医生的影响是什么？
a. 不依赖于培养，通过mNGS快速获取微生物的耐药信息。
细菌产生耐药的速度是惊人的。在未来中枢神经系统感染的诊治中，快速的获取耐药信息将对危重症的治疗有直接的影响。C.Y.Chiu教授的研究中展示了这种技术的可能性。
b.临床医生对病原微生物认识将发生颠覆性革新。
更多不典型的感染将被诊断而成为典型。
更多过去不认为会感染中枢神经系统的病原体将被认识。
更多免疫低下患者中的复合感染病原将被一一明确并精准治疗。
不可想象的新的发现将导致我们对中枢神经系统的炎症诊疗的认知产生天翻地覆的变化。基于这些病例，对临床提供再教育也是及其重要的。甚至将这些案例数据提供给人工智能，使得人工智能可以顺利的诊断更多罕见的脑炎。赵钢教授的“小神”团队正在着手于此。
随着C.Y.Chiu教授及关鸿志教授的重量级文章的发表，预示着mNGS技术可在真实世界为临床医生提供切实有效的病原筛查信息，并进一步展示了mNGS技术除感染筛查以外还可为临床真实世界提供有效的耐药信息。在中国必将有更大样本量的实验进一步验证并提出适合我国的阳性标准，使临床医生及病人从中获益。
参考书目
1. ClinicalMetagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis. Wilson, M.R., H. A. Sample, C. Y. Chiu (2019). ' N Engl J Med380(24):2327-2340.
2. Metagenomic Next-generationSequencing of Cerebrospinal Fluid for the Diagnosis of Central Nervous SystemInfections: A Multicentre Prospective Study. Siyuan FanMD1*, Xiaojuan Wang MD2*, Hongzhi Guan MD1. “ BroRxiv Jun. 10,2019; doi: http://dx.doi.org/10.1101/658047.
3. Evaluation of next generation sequencing for thediagnosis of active tuberculosis infection; Zhou Xian, AI Jing-wen, WenhongZhang et atl; <J Chinese Journal of Antituberculosis》1000-6621 2018240153-1562018-2
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