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2018年10月，在完善PVS1标准时，SVI工作组认为并非所有假定为LoF的变异都具有相同的PVS1证据强度，PVS1证据强度水平可能会因变异的类型而异。
因此，SVI工作组将PVS1标准分为PVS1、PVS1_Strong、PVS1_Moderate和PVS1_Supporting(对应的致病性相对比值是350:1、 18.7:1、18.7:1、2.08:1)(Tavtigian et al., 2018)。SVI工作组并未对每种证据类型或其组合进行量化，但为了保持解读这一规则的一致性，SVI工作组在确定PVS1强度水平之前，考虑了上述致病性相对比值(relative odds)。
①适用PVS1，需满足以下条件：
基因的临床有效性等级为“强STRONG ”或 “确定的DEFINITIVE”；
且≥3个LOF变异为致病性(不使用PVS1证据)；
且与表型相关的＞10%变异是LOF(必须覆盖＞1个外显子，除单个外显子基因)。
②适用PVS1_Strong，需满足以下条件：
基因的临床有效性等级为“中等MODERATE”及以上；
且≥2个LOF变异与表型相关(必须覆盖＞1个外显子，除单个外显子基因)。
且基因敲除小鼠模型再现了疾病表型。
③适用PVS1_Moderate，需满足以下条件：
基因的临床有效性等级为“中等MODERATE”及以上；
或合并≥2个LOF变异与表型相关(必须覆盖＞1个外显子，除单个外显子基因)。
或合并基因敲除小鼠模型再现了疾病表型。
因此如果没有证据表明LoF变异可以导致疾病，则不应用任何强度水平的PVS1。
值得注意的是，某些基因通过LoF机制致病，因携带变异的胚胎发生死亡，此类LoF变异就无法检测到。相反，致病变异的有害性影响较轻，则可以检出。因此，虽然上述提到的LoF变异数量上能达标“阈值”的基因，可能是大多数具有LoF疾病机制的基因(基因的临床有效性等级为确定性/强的)。但同时需要注意，由于存在LoF变异的胚胎致死性效应，检测不到此类，这也就达不到变异数量上阈值的要求，从而造成无法适用PVS1的情况。
应特别仔细地评估常染色体显性遗传性基因，因为即使有明确或强的疾病关联证据，也不一定能确定疾病机制(单倍剂量不足、功能获得或显性负性)。
ClinGen提供的单倍剂量不足(HI)评分和由ExAC提供的pLI评分可能有助于评估LoF是否为显性基因的潜在疾病机制。(下期再写)
基因的临床有效性(Clinical validity classification of gene)：实验室建立客观的方法对基因相关的证据进行评估和分类来确定基因和疾病的相关性，建议采用美国国立卫生研究院(NIH)的临床基因组资源组织(Clinical Genome Resource, ClinGen)发布的基因临床有效性管理标准操作程序，利用遗传学和实验证据评估基因的临床有效性，并定期对证据进行系统性回顾，以寻找是否出现新的证据支持，可用于定义和评估各种孟德尔疾病中基因疾病对的临床有效性。该框架提供了基因疾病关系证据强度的半定量评估：“确定性”、“强”、“中等”、“有限”、“无报告证据”或“冲突证据”。
终止密码子提前出现对mRNA和/或蛋白质产物的影响取决于新的终止密码子在转录本(最具有生物学意义的那个转录本)中的位置。
无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)作为真核细胞中重要RNA监控机制，识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子(premature termination codon, PTC)的mRNA，以避免因截短的蛋白产物积累对细胞造成毒害。NMD还调控正常生理基因的表达，暗示其在真核细胞中扮演重要角色。NMD途径的关键是PTC的识别。NMD通常由NMD因子UPF1(up-frameshift)等被招募至含PTC的mRNA上，借助这些因子组装形成“功能复合体”并激活降解。
一般情况下，如果终止密码子提前发生在大部分3'端的外显子或倒数第2个外显子的3'端的最多50个核苷酸内，则预测不会发生NMD。
当NMD预测不会发生时，需要确定截短的或改变的区域是蛋白的关键功能区，这通常由功能性实验或临床证据来支持蛋白质C末端区域的生物学功能(例如新终止密码子下游的致病变异)。根据这一证据，变异致病性的程度增加至~19:1的致病性比值。
如果功能实验证据表明截短区域对蛋白质功能不重要，那么需要评估该外显子对LoF变异的耐受性和该外显子在生物学相关转录本中的“去留”。
如果假定的LoF变异发生在预测可能会NMD的上游外显子上，那么在应用PVS1之前，必须评估该外显子的选择性剪接情况(是否与主要的或最具生物学相关转录本的相关)。
基于功能和/或表达性的证据，通常认为转录本或外显子具有生物学意义的。存在致病变异的外显子也会“留在”生物学相关转录本中。
转录本和外显子表达模式可以从文献或大型人类表达研究中获得，如基因型组织表达项目(Genotype-Tissue expression Project, GTEx)数据库。该数据库提供了组织特异性的外显子水平RNA测序数据，以及选择性剪接和外显子跳跃的信息。此外，也可以通过在RefSeq、CCDS、Ensembl和AceView等数据库了解转录本信息。
一般而言，如果假定的LoF变异影响外显子(该外显子在其他生物学相关转录本中缺失或在一般人群中富集)，则不使用任何强度水平的PVS1。
一般人群中，高频的LoF变异的阈值取决于特定的基因和/或疾病特征(患病率、基因贡献、等位基因异质性、遗传方式和外显率。每个疾病组应在估计其等位基因频率阈值的过程中来确定这个阈值)。
无义和移码变异(Nonsense and frameshift variants)
解读过程的第一步：确定新的终止密码子在与其最相关的转录本中的位置。如上文所述，这对于确定预测NMD是否会发生，或假定的LoF变异是否位于非必需的外显子中是至关重要。
非必需的外显子是指①在主要的转录本中，该外显子会被剪切掉，不保留在转录本中；②在一般人群中，该外显子富集高频的LoF变异；③删除了对蛋白质功能不关键的下游区域。
经典的±1,2 位剪接位点(Canonical ±1,2 splice variants)
是指内含子区域的变异，且靠近外显子的第一和第二位置，这类变异通常被认为(假定的)是具有LoF致病机制。U2剪接体供体和受体的主要核苷酸分别是GT和AG。
需要注意的是，对于这些变异，不应使用PP3标准(计算机模拟剪接预测)，以避免重复使用证据。不应该与剪切位点的软件预测(PP3)联合使用。
应该评估剪接位点变异附近(±20 bp)序列中任何隐匿性剪接位点，以及变异位点上新生成的功能性剪接位点，这些位点可能会重新恢复框内剪接。
应确定相邻外显子的核苷酸序列是否可被3整除，如果可以，那么这可能会导致原本完整的转录本发生框内缺失(in-frame deletion)。或者如果不能被3整除，则可能发生移码突变。因此，评估后认为，变异可能会引起隐匿性/新生成的剪接位点或发生外显子跳跃，此时，需要用PVS1的最低等级强度PVS1_supporting。
框内缺失：基因的阅读框没有被破坏，因此可以继续表达一些蛋白。这种蛋白的氨基酸序列比正常的短，因此它仍能保持一定的生物学功能
起始密码子(Initiation codon variants)
功能研究表明，在原来的起始位点的下游甚至上游的ATG或非ATG位点可以重新启动翻译。SVI工作组建议：造成起始密码子丢失的变异，不应使用PVS1或PVS1_Strong证据。
如果某个基因的其他转录本中没有可替代的其他起始密码子，且在最靠近潜在性的(框内)起始密码子(蛋氨酸)的5'端上游存在一个或多个已知的致病变异，那么建议：造成起始密码子丢失的变异，使用PVS1_Moderate证据。
外显子缺失(Exonic deletions)
如果某个基因符合LoF疾病机制的标准，那么整个基因的缺失，使用PVS1证据。SVI工作组认为，对于已知的单倍剂量不足的基因全缺失，只要没有相互矛盾的证据，就认为是致病的。
如果单个或多个外显子缺失是发生在最后两个外显子，请按照“缺失不改变阅读框”进行判定。
PVS1_Moderate和PM4(蛋白长度改变的变异)的使用存在重叠性。为防止这一证据重复使用，SVI工作组建议应用PVS1(任何强度水平)的同时，就不要再用PM4。
基因内重复(Intragenic duplications)
在临床实验室中，重复通常可以通过MLPA、CMA或NGS检出。虽然这些技术可以很容易地识别受影响的外显子，但重复区域的位置(即基因内或基因外)通常是未知的，这反过来可能影响变异致病性的判断。
PVS1不适用于已明确在基因外的外显子或全基因重复或以串联整个基因的形式的重复。
虽然不能假设重复是串联的，但目前的数据提示，至少83%的重复(包括外显子水平)是串联的(in tandem)。
因此，如果重复发生在未知的位置，预测会导致阅读框的位移位并引起NMD，此时使用PVS1_Strong证据。
重复必须完全包含在基因内并且大小≥1个外显子。如果重复中包含了最后一个外显子，则不适用PVS1。
如果无法预测重复对阅读框的影响，那么不适用PVS1。
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目前，AutoPVS1主要提供了三部分信息，分别是变异位点基本信息、基于变异位点特点的PVS1初始结果和基于疾病致病机理考量PVS1最终的结果。经过对PVS1解读指南里面专家解读的56个位点进行网站测试评估，AutoPVS1判断结果与专家解读的一致率为93%，提示AutoPVS1的自动化解读具有较高的准确性。
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