2015年

2015年，美国医学遗传学与基因组学学会(American college of medical genetics and genomics, ACMG)制定关于基因变异变异分类标准与指南，提出了8种证据来源、28条变异证据和5条致病性分类(“致病的”、“可能致病的”、“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”)，辅助医生的临床实践。

其中PP3证据：计算机软件预测(in silico predictions)包括了基因变异位点的保守性、剪接变异预测、错义变异的有害性预测。

2015年，ACMG指南中没有定义特定的软件算法和相应阈值，在临床实践应用时，不同计算机预测软件之间的差异会造成预测结果的差异。

2017

Ghosh等(2017)比较了25种计算机算法(in silico algorithms)对ClinVar数据库中的14819个错义变异(致病性和良性变异)预测情况，发现不同的算法工具对错义变异的有害性预测具有高度的不一致性。只有5.2%的良性变异、39.2%的致病变异在所有算法中结论一致。

除了在预测中缺乏完全一致性外，还发现不同算法之间的“假的一致性(false concordance)”。在ClinVar数据库773/7,346(10.5%)为良性变异，这些变异用五种常用算法预测均为致病性。相反，在7473个致病性变异中，有64个(0.8%)变异用五种算法预测均为良性。

仅评估三种常用的算法(Polyphen、SIFT和CADD)就可以获得了致病性(84%)和良性变异(46%)的较高一致性，同时假的一致性也在增加。

事实上，在18种算法中，有≥50%的算法将22.5%(1653/7346)的良性变异判定为致病性，其中有87个变异【ClinVar认可的专家组对变异的良性分类进行了审核(三星审核状态)，这提示这些变异是良性的】。

其中REVEL、MetaSVM算法，一致性最高

因此，这些算法的预测错误会使得基因变异偏向于临床意义未明变异(variants of uncertain significance, VUS)，对临床评估产生影响。

在短期内，临床实验室对基因变异进行基因功能实验以证实基因变异的致病性分类是不实用的、不及时的。因此，临床实验室必须最大限度地利用其他可用的信息来源。一个重要的资源是预测基因变异致病性的计算机方法，我们如何使用这些方法？Ghosh等认为，计算机模拟预测算法的不同组合将是对致病性和良性基因变异进行分类的最佳选择。临床遗传学界必须回答的问题是:在没有人、小鼠或其他实验的情况下，我们愿意冒多大程度的临床治疗风险并推动变异解读？

2021年

Wilcox等再次评估了计算机预测算法对基因变异(临床基因组资源(Clinical Genome Resource)专家组管理的727个错义变异)致病性分类的影响，以确定PP3和BP4的应用频率。

总体而言，727个错义变异中的429个(59%)应用了PP3和BP4标准。然而，PP3标准比BP4标准更常用(400次vs29次)，分别用于79%(149/189)和68%(147/215)的致病和可能致病错义变异。

PP3标准也用于50% (97/193)的VUS，仅用于7个良性或可能良性变异。相比之下，BP4标准主要用于可能良性(14/36, 30%)和良性(7/84, 8%)错义变异，偶尔用于8/193 (4%) VUS，从未用于可能致病或致病变异。

Wilcox等去除了PP3和BP4证据项，用ACMG指南中剩余的标准重新评估变异的致病性。移除PP3标准后，149个致病变异中的21个(14%)和147个可能致病变异中的36个(24%)分别降级为可能致病性变异和VUS。因此，在所有致病和可能致病的错义变异中，有14%(57/404)的最终分类中，PP3标准产生了差异。

相反，在去除BP4标准后，在14个可能良性错义变异中，有9个(64%)改为VUS；7个良性变异均未改变分类。总体而言，应用PP3和BP4标准改变了9%(66/720)错义变异的致病性分类；应用其中任一一个标准可改变15%(66/429)错义变异的致病性分类。

Wilcox等分析比较了变异致病性分类的ACMG/AMP分类系统与定量积分系统。

重新分类了应用PP3和BP4标准的错义变异的致病性，并量化了计算机模拟标准对最终致病性分类的贡献。在应用PP3和BP4支持性证据(±1)的422个错义变异中，定量积分系统有助于对66个变异(16%)进行最终致病性分类。

与之前提到的分析一致，这些变异大多数是致病或可能致病的错义变异，需要根据PP3标准才能达到最终分类(63/294或~21%)。具体而言，139个可能致病变异中，有36个(26%)在移除PP3标准后被重新分类为VUS。

Wilcox等评估了现有的计算机模拟工具在预测错义变异的致病性方面的性能(REVEL、VEST、FATHMM、MPC)，结果显示相对于其他的工具，这些工具有较好的预测性能。

VEST和REVEL是表现最佳的预测工具。例如，REVEL的最佳执行阈值为≥0.8(致病性)和≤0.4(良性)。

总之，研究强调了优化计算机预测工具的重要性，以便基因变异致病性分类能更恰当地使用PP3和BP4标准。这些数据提供了可靠的定量证据，表明在计算机模拟预测中，经过适当校准后，可以提供支持或中等水平的致病性证据。

2022年

2022年，ClinGen 序列变异解读工作组(ClinGen Sequence Interpretation Working Group)将贝叶斯框架拓展到计算机预测工具，将计算机预测工具的分数直接转换为PP3/BP4不同证据强度。该方法基于对已有变异的阳性预测值，从而校准计算机预测工具。

SVI评估了13种错义变异的计算机预测工具(BayesDel, CADD, Evolutionary Action，FATHMM, GERP++, MPC, MutPred2, PhyloP, PolyPhen-, PrimateAI, REVEL, SIFT、VEST4)，并统计不同证据强度的阈值。根据新阈值的统计结果，发现大多数工具达到了致病性和良性分类的supporting“支持”证据水平；多个工具达到了“moderate中等/强”证据水平；一些工具达到了“非常强”水平。采用最新的建议可能会使很多错义变异在致病性分类上有不同程度的提升，最高可达到“非常强”等级。

建议

1.在大多数情况下，建议临床实验室使用单一的工具和阈值，这些工具可以达到强水平的致病性证据和中等水平的良性证据(BayesDel, MutPred2, REVEL或VEST4)。这一建议最大限度地提高了可应用的证据强度，同时尽量减少支持和中等强度证据的假阳性预测数量。单一工具的重要性在于避免引入的偏倚。例如，通过多个工具来寻找某特定变异的最强证据等级，进行主观性选择。

2.尚未评估将PP3/BP4的错义变异有害性预测的方法与其他变异类型(如剪接、表达)的预测方法相组合的使用情况。预测错义变异(如蛋白质稳定性)的功能机制的计算方法不应与其他错义变异影响预测因素结合使用。

3.预测工具的选择(仅适用错义变异)：

1）工具应至少可以评级到强的致病性证据，如BayesDel, MutPred2, REVEL、VEST4。

2）对PP3/BP4给出的最大证据水平受到建议的阈值限制。

3）当PP3与PM1证据(变异位于热点或功能域的错义变异)一起应用时，应将组合起来证据限制为强的证据。例如，如果PM1为中等强度，PP3为强的证据(PP3_Strong)，则组合总证据应为强(PS)，而不是强+中等(PS+PM)。如果PM1和PP3_Moderate都是中等程度证据的组合(PM+PM)，那么组合起来证据就不会超过强的证据水平。

4）若在变异管理专家小组(variant curation expert panels, VCEPs), 临床实验室或研究小组已经开发出某基因特异性的预测工具，那么推荐实验室使用这类针对性的预测工具和阈值，而不是其他的标准工具。

附件

不同致病性证据，所适用的基因变异类型

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